טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס
Summary
השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, המאפשר הטיהור של התאים הסלולר איפה אנטיגנים אקסוגני מעובדים על ידי הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה במצגת-קרוס.
Abstract
תאים דנדריטים (Dc) מסוגלים מאוד עיבוד והצגת אנטיגנים אקסוגני למביטה על מחלקה histocompatibility הגדולות (MHC) אני מולקולות הידוע גם בשם צלב-מצגת (CP). CP ממלא תפקיד חשוב לא רק על הגירוי של תמים CD8+ T תאים וזיכרון CD8+ T תאים עבור זיהומיות וחסינות הגידול אלא גם ב איון של self-acting תמים T תאים על-ידי anergy תא T או מחיקה תא T. למרות המנגנון המולקולרי קריטי של CP נשאר כדי להיות הובהר, ראיות המצטבר מעיד כי אנטיגנים אקסוגני מתבצעות באמצעות רשתית תוך-פלזמית-הקשורים השפלה (עירד) לאחר הייצוא מקלאסי endocytic תאים. עד לאחרונה, אפיוני של תאים endocytic אלה היו מוגבלים כי היו אין סמנים מולקולריים ספציפי חוץ אנטיגנים אקסוגני. השיטה המתוארת כאן היא חדשה שלפוחית פרוטוקול בידוד, אשר מאפשר ולטיהור אלה תאים endocytic. משתמש זה מטוהרים microsome, אנחנו מחדש את עירד כמו תחבורה, ubiquitination, עיבוד של ה אנטיגן אקסוגני במבחנה, רומז כי המערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום מעובד אנטיגן אקסוגני לאחר ייצוא מזה תא הסלולר. פרוטוקול זה יכול להחיל עוד יותר על סוגי תאים אחרים כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי של CP.
Introduction
MHC אני מולקולות באים לידי ביטוי על פני השטח של כל התאים nucleated, עם פפטידים קצרים antigenic נגזר אנטיגנים אנדוגני, אשר מעובדות על-ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום ציטוזול1. לאחר עיבוד, פפטידים antigenic מועברים לתוך לומן (ER) רשתית תוך-פלזמית על ידי פפטיד לגבי המעלית מהברז. ב- ER לומן, סדרה של משגיחים ספציפית לסייע ההעמסה פפטיד, הנכון קיפול של MHC אני מורכבים. סדרה זו של מולקולות נקרא המתחם פפטיד העמסה (PLC), המציינת כי המיון תא מרכזי בשביל פפטיד מעמיסים על MHC אני2. לאחר טעינה, פפטיד MHC אני מולקולות מועברים אל פני השטח של התא, לשחק את תפקיד מרכזי במערכת החיסונית מסתגלת כמו סמני עצמית, ומאפשר CD8+ לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות (Ctl) כדי לזהות תאים סרטניים או מדבקים לפי antigenic פפטידים-עצמי חלבונים3.
פפטידים antigenic מ אקסוגני אנטיגנים אנטיגן הצגת תאים (APC), הם גם מוצג בעת MHC אני4,5,6,7,8 דרך CP, אשר מתבצע בעיקר ליד DCs9,10,11. CP חיוני הן עבור הפעלת תמים CD8+ T תאים וזיכרון CD8+ T תאים לתוך אנטי-זיהומית, anti-tumoral Ctl12,13, של קיום רגישות המערכת החיסונית על-ידי inactivating של בפועל עצמית תמים T תאים14,15. החפ ק ממלא תפקידים חשובים רבים במערכת החיסון מסתגלת, אולם טרם ניתן לתאר בפירוט המנגנונים המולקולריים של CP. מחקרים קודמים של CP חשף כי אנטיגנים אקסוגני נרשמו נקודתית הן המיון והן את אנדוזום, שעובדו על-ידי עירד, רומז כי אנטיגנים אקסוגני מועברים מ אנדוזום לחדר המיון עבור עירד כמו עיבוד ופפטיד טעינת16 . עם זאת, ראיות המצטבר עולה הטעינה פפטיד של CP מתבצעת לא בחדר המיון, אלא דווקא בקלאסי מדורים endocytic, יש גם את התכונות המיוחדות של ה ER (איור 1)17,18 ,19,20,21. כדי למנוע השפלה של סימנים מקדימים פפטיד antigenic על ידי פעילות גבוהה של aminopeptidase22 ציטוזול, עיבוד, פפטיד טעינה ב CP מתרחשת באזור הפרוקסימלית של אלה תאים endocytic-קלאסי (איור 1). למרות אפיוני של תאים endocytic אלה שנויים במחלוקת, יש אין מולקולות ספציפיות קיים מלבד אנטיגנים אקסוגני במחלקה הזו.
עירד הוא מסלול סלולרי, אשר במיוחד מסיר חלבונים misfolded מחדר המיון. ב מסלול עירד, חלבונים misfolded retrogradely מועבר דרך קרום אר אל הציטופלסמה, שעובדו על-ידי24,2523,מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום. כאשר מולקולות גדולות, כגון חלבונים, מועברים דרך ליפידית, מולקולות אלה עוברים דרך מנגנון מולקולרי הנקרא translocon, כגון Sec61 מתחם, מתחם מיון26, ו טום מורכבים Derlin וטים מתחם המיטוכונדריה27. כאשר exogenously-נוסף אנטיגנים מועברים דרך קרום בחדר המיון, הם חייבים לחדור ליפידית במתחם עם translocons, כגון המתחם Sec61. השיטה המתוארת כאן לטהר את שלפוחית ממוקד על ידי ניצול מולקולות אלה חודר ממברנה כסמני עבור התאים endocytic.
השיטה המתוארת כאן הוא פרוטוקול טיהור שלפוחית חדשה באמצעות את התא DC דמוי קו DC2.428 , biotinylated אובלבומין (בווה) כמו אנטיגן אקסוגני. התאים endocytic היו מטוהרת על-ידי streptavidin (SA)-beads מגנטי באמצעות את בווה חודר קרום כמו מכונת. זה מטוהרים microsome, כמה exogenously נוספו בווה השתמר עדיין בחלקים ממברנה אבל היו מועברים אל מחוץ microsome ולאחר מכן ubiquitinated ומעובדים במבחנה29. זה microsome מטוהרים הכיל לא רק חלבונים ספציפיים תא endocytic, אלא גם חלבוני ER-תושב עירד, את פפטיד טעינת מורכבים; רומז תא הסלולר הוא תא endocytic פוטנציאליים עבור CP29. פרוטוקול זה אינו תלוי הסוג של אנטיגנים אקסוגני, והוא גם ישימים עבור קבוצות משנה אחרים DC וסוגי תאים אחרים, כגון מקרופאגים, תאי B ותאי אנדותל, כדי להבהיר את המנגנון המולקולרי מדויק של בקרי קבוצת מחשבים CP שגורה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקרים קודמים של CP, אנטיגנים אקסוגני incorporated שהצטברו באזור הסגור של אנדוזום מאוחר או מיון על ידי מיקרוסקופ immunofluorescent16,30,31,32. ההערכה היא כי עירד כמו תחבורה, עיבוד של אנטיגנים אקסוגני מתבצעות באזורים מיוחדים אלה של מיון א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת טקסאקי של בריאות ורווחה.
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
References
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
