外因性の抗原クロス プレゼンテーション内の小胞体関連分解膜コンパートメントの精製
Summary
ここで説明する方法は、外因性の抗原クロス プレゼンテーションで小胞体関連分解によって処理される細胞コンパートメントの浄化は、新しい小胞の分離プロトコルです。
Abstract
樹状細胞 (Dc) は、主要組織適合抗原 (MHC) クラスに内面化された外因性抗原の提示や画像処理能力が高く、私分子として知られているクロス プレゼンテーション (CP)。CP は+ T ナイーブ CD8 の刺激だけでなく、重要な役割を果たしている細胞とメモリー CD8+ T 細胞の感染と動圧の不活性化にも腫瘍免疫ナイーブ T 細胞、T 細胞アネルギーや T 細胞削除。CP の重要な分子機構になって、蓄積された証拠を示すことが外因性の抗原は小胞体関連分解 (ERAD) 非古典からエクスポート後エンドサイトーシスを介して処理されます。コンパートメント。最近まで、外因性の抗原以外の特定の分子マーカーがなかったので、これらのエンドサイトーシスのコンパートメントの特徴は限られていた。ここで説明する方法は、これらのエンドサイトーシスのコンパートメントの浄化では、新しい小胞の分離プロトコルです。この精製微粒体を使用して、我々 再構成 ERAD のようなトランスポート、ユビキチン化、および外因性抗原の体外、処理ユビキチン-プロテアソーム システムがこれからの輸出後外因性抗原を処理することを示唆しています。細胞内コンパートメント。このプロトコルは、CP の分子機構を明らかにする他の細胞型にさらに適用できます。
Introduction
MHC 私分子すべての有核細胞の表面に細胞質1ユビキチン-プロテアソーム システムによって処理される内因性抗原由来抗原ペプチドを発現しています。処理後、抗原ペプチドは、ペプチド輸送体タップで小胞体 (ER) の内腔に運ばれます。小胞体内腔に特定シャペロンのシリーズは、ペプチドの読み込みと、フォールディング MHC I の複合体を支援します。分子のこのシリーズは、小胞体、ペプチドを MHC に私2の読み込みのため中央のコンパートメントであることを示すペプチド負荷複合体 (PLC) と呼ばれます。読み込み、ペプチッド MHC 後私分子細胞表面に運ばれ、キーとして役割を果たす適応免疫系の自己のマーカー、および CD8 を有効に+細胞傷害性 T リンパ球 (Ctl) がん細胞や感染性病原体を検出する抗原によって3非自己蛋白質由来ペプチド。
抗原提示細胞 (APC)、外因性の抗原の抗原性ペプチドもいる4,5,6,7,8 経由でCP、主に運ばれる私 MHC に提示で Dc9,10,11。CP が不可欠であるナイーブ CD8+ T の活性化のための両方セルとメモリ CD8 の不活化による+ T 細胞の免疫寛容の維持、抗感染症、抗腫瘍 Ctl12,13に自己演技ナイーブ T 細胞14,15。CP は、CP の分子メカニズムがまだ詳細に記載する適応免疫系の多くの重要な役割を果たしています。外因性の抗原が小胞体と、エンドソームの両方にローカライズされ、外因性の抗原がエンドソームから ERAD のような処理とペプチド16 の読み込みの小胞体に輸送されることを示唆している、ERAD で処理された CP の以前の研究で明らかに.しかし、蓄積された証拠は、小胞体ではなく、ER (図 1)17,18 の特徴がまたある非古典的エンドサイトーシス コンパートメントではなく CP のペプチド読み込みの実施を示します ,,1920,21。アミノペプチダーゼの高活性で抗原ペプチド前駆体の劣化を避けるためにこれらの非古典的エンドサイトーシス コンパートメント (図 1) の近位領域に細胞質、処理およびペプチドの CP で読み込みで22が発生します。これらのエンドサイトーシスのコンパートメントのキャラクタリゼーションが物議を醸すが、この区画で外因性の抗原以外の既存の特定の分子があります。
ERAD です具体的には小胞体からタンパク質を除去する細胞経路です。ERAD 経路の誤って折りたたまれたタンパク質は細胞質に小胞体膜を経由、ユビキチン-プロテアソーム システム23,24,25によって処理される逆行性。これらの分子が通過 Sec61 複合体とデルリン26ER と複雑なトムの複雑なティムなど、透過装置を複合体と呼ばれる分子装置、タンパク質などの大きな分子は脂質二重膜を輸送の際、ミトコンドリア27。外追加抗原は、小胞体膜を通じて転送されます、彼らは Sec61 複合体などの translocons との複合体の脂質二重膜を貫通する必要があります。ここで説明する方法は、エンドサイトーシスのコンパートメントのためのマーカーとしてこれらの膜貫通分子を利用してターゲットを絞った小胞を精製しました。
ここで説明する方法は、外因性抗原として DC のような細胞ライン DC2.428とビオチン化アルブミン (bOVA) を使用して新しい小胞浄化プロトコルです。エンドサイトーシスのコンパートメントにより精製されたストレプトアビジン (SA)-磁気ビーズ メーカーとして膜貫通ボーヴァを使用します。この精製のミクロゾームで外因 bOVA 膜画分でまだ維持されたが、ミクロソームとし、ユビキチンの外側に運搬・処理を追加いくつかの in vitro29。この精製ミクロゾーム ERAD とペプチド複合体での読み込みのエンドサイトーシスのコンパートメントに固有のタンパク質だけでなく、小胞体のタンパク質に含まれるCP29将来エンドサイトーシス コンパートメントを細胞内コンパートメントには示唆しています。このプロトコルは、外因性の抗原の種類に依存しない、また他 DC サブセットおよび他の細胞型、マクロファージ、B 細胞、内皮細胞など熟練した CP の Dc の正確な分子機構を明らかにするために適当。
Protocol
Representative Results
Discussion
CP の以前の研究で法人の外因性の抗原は蛍光顕微鏡観察16,30,31,32後期エンドソーム小胞体の制限区域に蓄積。ERAD のようなトランスポートおよび外因性抗原の処理は ER または後期エンドソームのこれらの専門分野の運ばれている推定されて細胞内コンパートメントは蔗糖あるいは iodixanol 密度勾配…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、高崎保健福祉大学のによってサポートされます。
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
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