Medición de las densidades de gafas acuosas a temperaturas criogénicas

Las propiedades físicas del agua y de las mezclas acuosas en sus diversas fases son de interés fundamental y son importantes para la comprensión in vivo e in vitro de los sistemas biológicos. En la criobiología contemporánea y la crioconservación biológica, las fases vítreas o amorfas de las mezclas acuosas de crioprotectores son de particular interés ^{1 , 2} . La nucleación y el crecimiento de los cristales de hielo pueden interrumpir las células y los tejidos, y promover la desnaturalización y agregación de proteínas, por lo que los protocolos de crioconservación que vitrifican el disolvente se han vuelto cada vez más populares. En la cristalografía biomolecular, la cristalización del disolvente en los canales entre las biomoléculas interrumpe las rejillas de cristal y degrada las propiedades de difracción. La vitrificación se consigue a través de una combinación de enfriamiento rápido, deshidratación y adición de solutos crioprotectores tales como glicerol, etilenglicol, polietilenglicoles (PEGs),Alcoholes y sales.

La vitrificación limita la cristalización y el crecimiento del hielo, pero no elimina todos los daños relacionados con la refrigeración. Por ejemplo, la mosaicidad cristalina (una medida de la distribución de las orientaciones de los planos de cristal) aumenta rutinariamente en un factor de 10 a 100 cuando los cristales de proteína se enfrían en un estado vitrificado ³ , y las tasas de supervivencia de espermatozoides vitrificados y ovocitos varían ampliamente .

Un mecanismo de daño es la contracción diferencial del disolvente y del material circundante durante el enfriamiento ^{3 , 4 , 5} . El disolvente de equilibrio y las concentraciones de soluto dentro de un cristal, célula o tejido son dependientes de la temperatura, y el disolvente más el soluto y el material circundante pueden contraerse en diferentes cantidades. El enfriamiento rápido puede prevenir la redistribución del solvente y del soluto antes de la vitrificación, y Puede conducir a tensiones grandes, inhomogéneas y no equilibradas que causan daño a la muestra.

Por lo tanto, los enfoques racionales para reducir el daño inducido por refrigeración podrían beneficiarse del conocimiento de las densidades dependientes de la temperatura de las mezclas acuosas líquidas y vitrificadas. A concentraciones de soluto superiores al 50% en peso de soluto a peso de solución (p / p), la mayoría de las mezclas de crioprotectores acuosos pueden vitrificarse con tasas de enfriamiento modestas de 10 K / s o menos, permitiendo la producción y medidas de densidad usando muestras vítreas grandes ⁶ . La densidad puede entonces determinarse usando el principio de Arquímedes, midiendo el peso aparente de la muestra cuando se suspende en un criógeno líquido como nitrógeno. Sin embargo, a medida que disminuye la concentración de soluto, las velocidades de enfriamiento requeridas para la vitrificación aumentan rápidamente: Las velocidades de enfriamiento para mezclas acuosas de glicerol aumentan de <10 K / s a ​​50% en peso de soluto en g al volumen de solución en ml (p / v) K / sa 25% p / vAsno = "xref"> 7. La transferencia de calor se limita a la capa límite, de modo que lograr mayores tasas de enfriamiento requiere muestras cada vez más pequeñas ⁸ .

Las mediciones de la densidad de agua vítrea pura y hielo se han conseguido depositando gotas de diámetro micrométrico (volumen de femtolitro) en vacío sobre una superficie enfriada criogénicamente para construir una muestra macroscópica (masa gramatical). La densidad de esta muestra se determinó mediante crioflotación en una mezcla de nitrógeno líquido-argón, en la que se ajustó la densidad del líquido criogénico hasta que la muestra se volvió neutralmente flotante ⁹ . Sin embargo, la generación de grandes muestras de un gran número de pequeñas gotas de una manera que minimiza los volúmenes de vacío – una importante fuente de error en las mediciones anteriores de la densidad de la fase vítrea – no es trivial. Para las mezclas acuosas, la evaporación diferencial de los componentes de la solución durante la aerosolización y la deposición en vacío puede conducir aIncertidumbres sustanciales en las concentraciones depositadas.

Hemos desarrollado un método, basado en cryoflotation, que permite la determinación precisa de la densidad de mezclas acuosas utilizando gotas individuales tan pequeñas como 50 pL ¹⁰ . Estas gotas pueden enfriarse rápidamente mientras se mantienen sus concentraciones originales, y su estado de temperatura criogénica (vitrificado o cristalino) se puede evaluar usando un ensayo visual simple que se correlaciona con mediciones de difracción de rayos X. Este método es ampliamente aplicable a mezclas acuosas y no acuosas, y puede extenderse a una variedad de muestras biológicas que incluyen células ( vg , tallos y huevos), muestras de tejido y cristales de proteína que tienen densidades a baja temperatura entre 0,8 y 1,4 g / Ml.