Misurare le densità di vetri acquosi a temperature criogeniche

Le proprietà fisiche dell'acqua e delle miscele acquose nelle loro varie fasi sono di interesse fondamentale e sono importanti per la comprensione in vivo e in vitro dei sistemi biologici. Nella criobiologia contemporanea e nella crioconservazione biologica sono particolarmente interessanti le fasi vitreose o amorfe di miscele crioprotectanti acquose ^{1 , 2} . La nucleazione e la crescita dei cristalli di ghiaccio possono interrompere le cellule e i tessuti e promuovere la denaturazione e l'aggregazione delle proteine, per cui i protocolli di crioconservazione che vitrificano il solvente sono diventati sempre più popolari. Nella cristallografia biomolecolare, la cristallizzazione del solvente nei canali tra biomolecole distrugge i cristalli di cristallo e degrada le proprietà di diffrazione. La vitrificazione viene ottenuta attraverso una combinazione di rapido raffreddamento, disidratazione e aggiunta di solventi crioprotettori quali glicerolo, glicole etilenico, glicoli polietilenici (PEG),Alcoli e sali.

Vitrificazione limita la cristallizzazione e la crescita del ghiaccio, ma non elimina tutti i danni provenienti dal raffreddamento. Per esempio, la mosaicità di cristallo (una misura della distribuzione degli orientamenti del piano di cristallo) aumenta regolarmente di un fattore da 10 a 100 quando i cristalli proteici vengono raffreddati in uno stato vitrificato ³ e i tassi di sopravvivenza post-dissolti delle cellule spermatiche e degli ovociti vitrificati variano ampiamente .

Un meccanismo di danno è la contrazione differenziale del solvente e del materiale circostante durante il raffreddamento ^{3 , 4 , 5} . Il solvente di equilibrio e le concentrazioni di soluto all'interno di un cristallo, di una cellula o di un tessuto dipendono dalla temperatura e il solvente più il soluto e il materiale circostante possono contrattare per quantità diverse. Il raffreddamento rapido può impedire la ridistribuzione del solvente e del soluto prima della vitrificazione e dei contratti differenziali Può provocare grandi sollecitazioni inhomogenei e non equilibri che causano danni al campione.

Gli approcci razionali per la riduzione dei danni causati dal raffreddamento potrebbero quindi beneficiare della conoscenza delle densità dipendenti dalla temperatura delle miscele acquose liquide e vetrificate. A concentrazioni di solventi superiori al 50% del soluto al peso della soluzione (w / w), la maggior parte delle miscele crioprotectanti acquose possono essere vitrificate con modesti tassi di raffreddamento di 10 K / s o meno, permettendo la produzione e la misurazione di densità utilizzando grandi campioni di vitreo ⁶ . La densità può quindi essere determinata usando il principio di Archimede, misurando il peso apparente del campione quando sospeso in un criogenico liquido come l'azoto. Tuttavia, poiché la concentrazione del soluto diminuisce, i tassi di raffreddamento richiesti per la vitrificazione aumentano rapidamente: i tassi di raffreddamento per le miscele acquose di glicole aumentano da <10 K / s al 50% di soluto in g al volume di soluzione in ml (v / v) a> 1.000 K / s al 25% in pesoAss = "xref"> 7. Il trasferimento di calore diventa limitato per i livelli di confine, in modo che raggiungere grandi velocità di raffreddamento richiedano campioni più piccoli e minori ⁸ .

Le misure della densità dell'acqua e del ghiaccio puro sono state ottenute depositare gocce di diametro del micrometro (volume femtolitore) in un vuoto su una superficie criogenica raffreddata in modo da costruire un campione macroscopico (massa grammaticale). La densità di questo campione è stata determinata mediante crioflotazione in una miscela di azoto-argon liquido in cui è stata regolata la densità del liquido criogenico fino a quando il campione è diventato neutrale ⁹ . Tuttavia, generare grandi campioni da un gran numero di piccole gocce in modo da ridurre al minimo i volumi vuoti – una fonte importante di errore nelle precedenti misurazioni di densità di fase in vitreo – non è banale. Per miscele acquose, l'evaporazione differenziale dei componenti della soluzione durante l'aerosolizzazione e la deposizione in un vuoto può portare aConsistenti incertezze nelle concentrazioni depositate.

Abbiamo sviluppato un metodo basato su crioflotazione che consente una precisa determinazione della densità di miscele acquose utilizzando singole gocce minori di 50 pL ¹⁰ . Queste gocce possono essere rapidamente raffreddate pur mantenendo le loro concentrazioni originali e il loro stato di temperatura criogenica (vetrificato o cristallino) può essere valutato utilizzando un semplice test visivo correlato alle misure di diffrazione del raggio X. Questo metodo è ampiamente applicabile a miscele acquose e non acquose e può essere esteso ad una varietà di campioni biologici, incluse le cellule ( ad es . Stelo e uovo), campioni di tessuto e cristalli proteici aventi densità a bassa temperatura tra 0,8 e 1,4 g / mL.