Mesurer les densités des verres aqueux aux températures cryogéniques

Les propriétés physiques de l'eau et des mélanges aqueux dans leurs différentes phases sont d'un intérêt fondamental et sont importantes pour la compréhension in vivo et in vitro des systèmes biologiques. Dans la cryobiologie contemporaine et la cryoconservation biologique, les phases vitreuses ou amorphes des mélanges cryoprotecteurs aqueux présentent un intérêt particulier ^{1 , 2} . La nucléation et la croissance des cristaux de glace peuvent perturber les cellules et les tissus et favoriser la dénaturation et l'agrégation des protéines, de sorte que les protocoles de cryoconservation qui vitrifient le solvant sont devenus de plus en plus populaires. Dans la cristallographie biomoléculaire, la cristallisation du solvant dans les canaux entre les biomolécules perturbe les réseaux cristallins et dégrade les propriétés de diffraction. La vitrification s'effectue grâce à une combinaison de refroidissement rapide, de déshydratation et d'addition de solutés cryoprotecteurs tels que le glycérol, l'éthylène glycol, les polyéthylèneglycols (PEG)Les alcools et les sels.

La vitrification limite la cristallisation et la croissance de la glace, mais n'élimine pas tous les dégâts des échantillons liés au refroidissement. Par exemple, la mosaïque des cristaux (une mesure de la distribution des orientations du plan de cristaux) augmente régulièrement de 10 à 100 lorsque les cristaux de protéines sont refroidis dans un état vitrifié ³ et les taux de survie post-décongélation des spermatozoïdes et des ovocytes vitrifiés varient considérablement .

Un mécanisme de dégâts est la contraction différentielle du solvant et du matériau environnant pendant le refroidissement ^{3 , 4 , 5} . Les concentrations de solvant et de soluté à l'équilibre dans un cristal, une cellule ou un tissu dépendent de la température, et le solvant plus le soluté et le matériau environnant peuvent se contracter par des quantités différentes. Un refroidissement rapide peut empêcher la redistribution des solvants et des solutés avant la vitrification et le contraction différentielle Peut conduire à des contraintes de déséquilibre, non homogènes, qui causent des dommages à l'échantillon.

Les approches rationnelles pour réduire les dommages induits par le refroidissement pourraient ainsi bénéficier de la connaissance des densités dépendant de la température des mélanges aqueux liquides et vitrifiés. À des concentrations de soluté supérieures à 50% en poids de soluté en poids de solution (p / p), la plupart des mélanges de cryoprotecteurs aqueux peuvent être vitrifiés avec des taux de refroidissement modérés de 10 K / s ou moins, permettant une production et des mesures de densité à l'aide de grands échantillons de vitre ⁶ . La densité peut ensuite être déterminée en utilisant le principe d'Archimède, en mesurant le poids apparent de l'échantillon lorsqu'il est mis en suspension dans un cryogène liquide comme l'azote. Cependant, au fur et à mesure que la concentration de soluté diminue, les vitesses de refroidissement requises pour la vitrification augmentent rapidement: les taux de refroidissement des mélanges aqueux de glycérol augmentent de <10 K / s à 50% en poids de soluté en volume de solution en ml (p / v) à> 1 000 K / s à 25% p / vAss = "xref"> 7. Le transfert de chaleur devient limité à la couche limite, de sorte que l'obtention de plus grands taux de refroidissement nécessite des échantillons plus petits et plus petits ⁸ .

Des mesures de la densité de l'eau vitreuse pure et de la glace ont été réalisées en déposant des quantités de diamètre micrométrique (volume femtoliter) dans un vide sur une surface cryogénique afin de constituer un échantillon macroscopique (masse gramme). La densité de cet échantillon a été déterminée par cryoflotation dans un mélange azote-argon liquide, dans lequel la densité du liquide cryogénique a été ajustée jusqu'à ce que l'échantillon soit neutre ⁹ . Cependant, générer de gros échantillons à partir d'un grand nombre de petites gouttes d'une manière qui minimise les volumes de vide – une source importante d'erreur dans les mesures précédentes de la densité de la phase vitreuse – n'est pas trivial. Pour les mélanges aqueux, l'évaporation différentielle des composants de la solution pendant l'aérosolisation et le dépôt sous vide peut conduire àIncertitudes substantielles dans les concentrations déposées.

Nous avons développé une méthode, basée sur la cryoflotation, qui permet une détermination précise de la densité des mélanges aqueux en utilisant des gouttes individuelles aussi petites que 50 pL ¹⁰ . Ces gouttes peuvent être rapidement refroidies tout en conservant leurs concentrations initiales, et leur état de température cryogénique (vitrifié ou cristallin) peut être évalué à l'aide d'un test visuel simple qui est en corrélation avec les mesures de diffraction des rayons X. Cette méthode est largement applicable aux mélanges aqueux et non aqueux, et peut être étendue à une variété d'échantillons biologiques comprenant des cellules ( p . Ex . Tige et œuf), des échantillons de tissus et des cristaux de protéines ayant des densités à basse température comprises entre 0,8 et 1,4 g / Ml.