Summary

Messung der Dichte von wässrigen Gläsern bei kryogenen Temperaturen

Published: June 28, 2017
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Summary

Ein Protokoll zur Bestimmung der Glaskapseldichten von Mikro- bis Pico-Liter-Größen-Tropfen von wässrigen Mischungen bei kryogenen Temperaturen wird beschrieben.

Abstract

Wir zeigen ein Verfahren zur Bestimmung der kryogenen Temperaturdichten der vitrusphasen von wässrigen Mischungen und anderer Proben, die eine schnelle Abkühlung erfordern, um die gewünschte kryogene Temperaturphase herzustellen. Mikroliter zu Picoliter-Größen-Tropfen werden durch Projektion in ein flüssiges Stickstoff-Argon (N 2 -Ar) -Mischung gekühlt. Die kryogene Temperaturphase des Tropfens wird unter Verwendung eines visuellen Assays ausgewertet, der mit Röntgenbeugungsmessungen korreliert. Die Dichte der flüssigen N 2 -Ar-Mischung wird durch Zugabe von N 2 oder Ar eingestellt, bis der Tropfen neutral schwimmfähig wird. Die Dichte dieser Mischung und damit des Tropfens wird nach einer Testmasse und dem Archimedes-Prinzip bestimmt. Mit geeigneter Sorgfalt bei der Tropfenvorbereitung, dem Management des Gases über dem flüssigen Kryogengemisch zur Minimierung der Vereisung und dem regelmäßigen Mischen des kryogenen Gemisches, um eine Dichte-Schichtung und eine Phasentrennung zu verhindern, können die Dichten auf <0,5% der Tropfen, die so klein wie 50 pl sind, genau seinLeicht bestimmt werden. Messungen an wässrigen Kryoschutzmittelgemischen liefern Einblicke in die Kryoschutzwirkung und liefern quantitative Daten zur Erleichterung der thermischen Kontraktionsanpassung in der biologischen Kryokonservierung.

Introduction

Die physikalischen Eigenschaften von Wasser und wässrigen Mischungen in ihren verschiedenen Phasen sind von grundlegender Bedeutung und sind für das in vivo und in vitro Verständnis der biologischen Systeme wichtig. In der zeitgenössischen Kryobiologie und der biologischen Kryokonservierung sind die glasartigen oder amorphen Phasen von wässrigen Kryoschutzmittelgemischen von besonderem Interesse 1 , 2 . Die Nukleierung und das Wachstum von Eiskristallen können Zellen und Gewebe stören und die Proteindenaturierung und Aggregation fördern, so dass Kryokonservierungsprotokolle, die das Lösungsmittel verglasen, zunehmend populär geworden sind. In der biomolekularen Kristallographie stört die Kristallisation des Lösungsmittels in den Kanälen zwischen Biomolekülen Kristallgitter und verschlechtert die Beugungseigenschaften. Die Verglasung wird durch eine Kombination aus Schnellkühlung, Dehydratisierung und Zugabe von kryoprotektiven Soluten wie Glycerin, Ethylenglykol, Polyethylenglykolen (PEGs),Alkohol und salze.

Die Verglasung begrenzt die Eiskristallisation und das Wachstum, eliminiert jedoch nicht alle kühlbedingten Probenschäden. Zum Beispiel erhöht die Kristallmosaik (ein Maß für die Verteilung der Kristallebenenorientierungen) routinemäßig um einen Faktor von 10 bis 100, wenn Proteinkristalle in einen verglasten Zustand 3 abgekühlt werden, und die Nachtrocknen-Überlebensraten von verglasten Spermien und Oozyten variieren stark .

Ein Schadensmechanismus ist eine differentielle Kontraktion von Lösungsmittel und umgebendem Material während der Kühlung 3 , 4 , 5 . Die Gleichgewichtslösungsmittel- und Lösungskonzentrationen innerhalb eines Kristalls, einer Zelle oder eines Gewebes sind temperaturabhängig, und das Lösungsmittel plus der gelöste und das umgebende Material kann sich durch unterschiedliche Mengen zusammenziehen. Die schnelle Abkühlung kann vor der Verglasung Lösungsmittel- und Lösungsumverteilung verhindern und Differentialverträge Kann zu großen, inhomogenen, Nichtgleichgewichtsbelastungen führen, die Probenschäden verursachen.

Rationale Ansätze zur Reduzierung von kühlbedingten Schäden könnten somit von der Kenntnis der temperaturabhängigen Dichten von flüssigen und verglasten wässrigen Gemischen profitieren. Bei Lösungskonzentrationen über 50 Gew .-% Lösemittel an Gewicht der Lösung (Gew./Gew.) Können die meisten wässrigen Kryoschutzmittelmischungen mit bescheidenen Abkühlgeschwindigkeiten von 10 K / s oder weniger verglast werden, was die Herstellung und die Dichtemessung mit großen Glaskörperproben ermöglicht. Die Dichte kann dann nach dem Archimedes-Prinzip bestimmt werden, indem man das scheinbare Gewicht der Probe misst, wenn es in einem flüssigen Kryogen wie Stickstoff suspendiert wird. Wenn jedoch die Konzentration des gelösten Stoffes abnimmt, steigen die für die Verglasung erforderlichen Abkühlgeschwindigkeiten rasch an: Die Abkühlgeschwindigkeiten für wässrige Glycerinmischungen steigen von <10 K / s bei 50 Gew .-% des gelösten Stoffes in g bis zum Volumen der Lösung in ml (w / v) bis> 1000 an K / s bei 25% w / vAss = "xref"> 7 Wärmeübertragung wird Grenzschicht begrenzt, so dass das Erreichen größerer Abkühlgeschwindigkeiten kleinere und kleinere Proben erfordert 8 .

Messungen der Dichte von reinem Glaskörper und Eis wurden durch Abscheiden von Mikrometer-Durchmesser (Femtoliter-Volumen) Tropfen im Vakuum auf eine kryogenisch gekühlte Oberfläche erreicht, um eine makroskopische (Gramm) Probe aufzubauen. Die Dichte dieser Probe wurde durch Kryoflotation in einer flüssigen Stickstoff-Argon-Mischung bestimmt, bei der die Dichte der kryogenen Flüssigkeit eingestellt wurde, bis die Probe neutral schwach wurde 9 . Allerdings ist die Erzeugung von großen Proben aus einer großen Anzahl von kleinen Tropfen in einer Weise, die Hohlraumvolumina minimiert – eine wichtige Fehlerquelle in früheren Glaskörper-Dichte-Messungen – ist nicht trivial. Für wässrige Mischungen kann die Differenzverdampfung von Lösungskomponenten bei der Aerosolisierung und Abscheidung im Vakuum dazu führenErhebliche Unsicherheiten bei abgelagerten Konzentrationen.

Wir haben eine Methode entwickelt, die auf Kryoflotation basiert und eine genaue Dichtebestimmung von wässrigen Mischungen mit einzelnen Tropfen ermöglicht, die so klein wie 50 pL 10 sind . Diese Tropfen können unter Beibehaltung ihrer ursprünglichen Konzentrationen schnell gekühlt werden, und ihr kryogener Temperaturzustand (verglast oder kristallin) kann mit einem einfachen visuellen Assay beurteilt werden, der mit Röntgenbeugungsmessungen korreliert. Dieses Verfahren ist weitgehend auf wässrige und nicht-wässrige Mischungen anwendbar und kann auf eine Vielzahl von biologischen Proben einschließlich Zellen ( z. B. Stamm und Ei), Gewebeproben und Proteinkristallen mit Niedrigtemperaturdichten zwischen 0,8 und 1,4 g / ML

Protocol

ACHTUNG: Bitte konsultieren Sie vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken bei der Verwendung von komprimierten Gasen, einschließlich geeigneter kalibrierter Gashandhabungsregler und Ventile sowie zugelassener Gasschläuche. Kontakt mit flüssigen Kryogenen kann schwere Erfrierungen und Nekrose verursachen. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Gesichtsschutz, Handschuhe, Laborkittel, Volllängenhosen, Zehenspitzenschuhe),…

Representative Results

Dichtemessungen bei T = 77 K für keramische Tropfen von wässrigem Glycerin und Ethylenglykol gegenüber der Kryoschutzmittelkonzentration sind in Fig. 1A bzw. Fig. 1B gezeigt, und die entsprechende Änderung des spezifischen Volumens zwischen T = 298 K und 77 K, die vorher berechnet wurde Bestimmt T = 298 K Dichten, ist in Abbildung 2 dargestellt . Bei hohen Kryoschutzmi…

Discussion

Die derzeitigen Geräte und Methoden, die vor allem von Studenten mit eingeschränktem Zugang zu Instrumentenbauwerkzeugen und Maschinen entwickelt wurden, liefern dennoch hochgenaue Dichtemessungen für einzelne Flüssigkeitstropfen von nur 50 pL. In dem Konzentrationsbereich nahe und über 50% w / w, wo kleine Abkühlgeschwindigkeiten ausreichen, um keramische Proben zu erhalten, stimmen die Dichten mit denen überein, die in früheren Messungen an Massenproben erhalten wurden. Extrapolationen der vorliegenden Dichten…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der NSF unter der Auszeichnung MCB-1330685 unterstützt. DWM erkennt die Teilunterstützung von der Cornell University Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32GM0082567) an.

Materials

centrifuge tube Falcon 6029236 15 mL conical centrifuge tube
glycerol, >99.5% Sigma  G9012-100 mL
ethylene glycol, >99.8% Sigma 324558-100 mL
analytical microbalance Mettler AE240 Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance 
vortexer Scientific Industries SI-0236 Vortex-Genie 2
Apparatus enclosure framing Unistrut  1-5/8" metal framing 48" wide x 24" deep x 40" tall 
Apparatus enclosure air barrier any clear plastic sheeting
neoprene rubber disk 4" diameter, 1/8" thick
dewar flask Scilogix Dilvac SS333 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid
copper chamber This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end.  The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7".
nitrogen gas Airgas NI HP300 99.998% pure N2 gas
argon gas Airgas AR HP300 99.998% pure Ar gas
rotameter Omega FL3692ST 2.52 l/min max flow rate
foam insulating lid This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79".    
PTFE test mass This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. 
microbalance platform Unistrut 1-5/8" metal framing 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass
2 mil (50 um) monofilament line Berkley NF1502-CM Nanofil fishing line
Argon precooling coil tubing VWR 60985-512 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing
perforated copper foil mixer 1.4" diameter,  35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool.  Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed.
syringe BD 309628 1 ml Luer-Lok tip syringe
vacuum generator Gast VG-015-00-00 compressed air venturi single stage vacuum generator
hydrophobic coating spray RainX 620036 plastic water repellent
long focal length stereo microscope Bausch and Lomb Stereozoom 6 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance 
LED ring illuminator Amscope LED144S
LED spot illuminator Newhouse Lighting NHCLP-LED 3W LED gooseneck clamp lamp
1.8 ml cryo vial Nunc V7634-500EA Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate

References

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Cite This Article
Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Dan, R., Moreau, D. W., Thorne, R. Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures. J. Vis. Exp. (124), e55761, doi:10.3791/55761 (2017).

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