Messung der Dichte von wässrigen Gläsern bei kryogenen Temperaturen

Die physikalischen Eigenschaften von Wasser und wässrigen Mischungen in ihren verschiedenen Phasen sind von grundlegender Bedeutung und sind für das in vivo und in vitro Verständnis der biologischen Systeme wichtig. In der zeitgenössischen Kryobiologie und der biologischen Kryokonservierung sind die glasartigen oder amorphen Phasen von wässrigen Kryoschutzmittelgemischen von besonderem Interesse ^{1 , 2} . Die Nukleierung und das Wachstum von Eiskristallen können Zellen und Gewebe stören und die Proteindenaturierung und Aggregation fördern, so dass Kryokonservierungsprotokolle, die das Lösungsmittel verglasen, zunehmend populär geworden sind. In der biomolekularen Kristallographie stört die Kristallisation des Lösungsmittels in den Kanälen zwischen Biomolekülen Kristallgitter und verschlechtert die Beugungseigenschaften. Die Verglasung wird durch eine Kombination aus Schnellkühlung, Dehydratisierung und Zugabe von kryoprotektiven Soluten wie Glycerin, Ethylenglykol, Polyethylenglykolen (PEGs),Alkohol und salze.

Die Verglasung begrenzt die Eiskristallisation und das Wachstum, eliminiert jedoch nicht alle kühlbedingten Probenschäden. Zum Beispiel erhöht die Kristallmosaik (ein Maß für die Verteilung der Kristallebenenorientierungen) routinemäßig um einen Faktor von 10 bis 100, wenn Proteinkristalle in einen verglasten Zustand ³ abgekühlt werden, und die Nachtrocknen-Überlebensraten von verglasten Spermien und Oozyten variieren stark .

Ein Schadensmechanismus ist eine differentielle Kontraktion von Lösungsmittel und umgebendem Material während der Kühlung ^{3 , 4 , 5} . Die Gleichgewichtslösungsmittel- und Lösungskonzentrationen innerhalb eines Kristalls, einer Zelle oder eines Gewebes sind temperaturabhängig, und das Lösungsmittel plus der gelöste und das umgebende Material kann sich durch unterschiedliche Mengen zusammenziehen. Die schnelle Abkühlung kann vor der Verglasung Lösungsmittel- und Lösungsumverteilung verhindern und Differentialverträge Kann zu großen, inhomogenen, Nichtgleichgewichtsbelastungen führen, die Probenschäden verursachen.

Rationale Ansätze zur Reduzierung von kühlbedingten Schäden könnten somit von der Kenntnis der temperaturabhängigen Dichten von flüssigen und verglasten wässrigen Gemischen profitieren. Bei Lösungskonzentrationen über 50 Gew .-% Lösemittel an Gewicht der Lösung (Gew./Gew.) Können die meisten wässrigen Kryoschutzmittelmischungen mit bescheidenen Abkühlgeschwindigkeiten von 10 K / s oder weniger verglast werden, was die Herstellung und die Dichtemessung mit großen Glaskörperproben ermöglicht. Die Dichte kann dann nach dem Archimedes-Prinzip bestimmt werden, indem man das scheinbare Gewicht der Probe misst, wenn es in einem flüssigen Kryogen wie Stickstoff suspendiert wird. Wenn jedoch die Konzentration des gelösten Stoffes abnimmt, steigen die für die Verglasung erforderlichen Abkühlgeschwindigkeiten rasch an: Die Abkühlgeschwindigkeiten für wässrige Glycerinmischungen steigen von <10 K / s bei 50 Gew .-% des gelösten Stoffes in g bis zum Volumen der Lösung in ml (w / v) bis> 1000 an K / s bei 25% w / vAss = "xref"> 7 Wärmeübertragung wird Grenzschicht begrenzt, so dass das Erreichen größerer Abkühlgeschwindigkeiten kleinere und kleinere Proben erfordert ⁸ .

Messungen der Dichte von reinem Glaskörper und Eis wurden durch Abscheiden von Mikrometer-Durchmesser (Femtoliter-Volumen) Tropfen im Vakuum auf eine kryogenisch gekühlte Oberfläche erreicht, um eine makroskopische (Gramm) Probe aufzubauen. Die Dichte dieser Probe wurde durch Kryoflotation in einer flüssigen Stickstoff-Argon-Mischung bestimmt, bei der die Dichte der kryogenen Flüssigkeit eingestellt wurde, bis die Probe neutral schwach wurde ⁹ . Allerdings ist die Erzeugung von großen Proben aus einer großen Anzahl von kleinen Tropfen in einer Weise, die Hohlraumvolumina minimiert – eine wichtige Fehlerquelle in früheren Glaskörper-Dichte-Messungen – ist nicht trivial. Für wässrige Mischungen kann die Differenzverdampfung von Lösungskomponenten bei der Aerosolisierung und Abscheidung im Vakuum dazu führenErhebliche Unsicherheiten bei abgelagerten Konzentrationen.

Wir haben eine Methode entwickelt, die auf Kryoflotation basiert und eine genaue Dichtebestimmung von wässrigen Mischungen mit einzelnen Tropfen ermöglicht, die so klein wie 50 pL ^{10 sind} . Diese Tropfen können unter Beibehaltung ihrer ursprünglichen Konzentrationen schnell gekühlt werden, und ihr kryogener Temperaturzustand (verglast oder kristallin) kann mit einem einfachen visuellen Assay beurteilt werden, der mit Röntgenbeugungsmessungen korreliert. Dieses Verfahren ist weitgehend auf wässrige und nicht-wässrige Mischungen anwendbar und kann auf eine Vielzahl von biologischen Proben einschließlich Zellen ( z. B. Stamm und Ei), Gewebeproben und Proteinkristallen mit Niedrigtemperaturdichten zwischen 0,8 und 1,4 g / ML