Laboratoriumtechnieken die gebruikt worden om biotypes van te houden en te onderscheiden<em> Vibrio cholerae</em> Klinische en milieu-isolaten

Cholera is een ziekte van de distale dunne darm, veroorzaakt door de consumptie van verontreinigd voedsel of water dat de aquatische Gram-negatieve bacterie Vibrio cholerae bevat . Symptomen van cholera omvatten braken en onbeheersbare waterige diarree, wat leidt tot ernstige uitdroging, die, indien niet goed behandeld, tot de dood zal leiden. V. Cholerae kan worden verdeeld in meer dan 200 serogroepen op basis van de structuur van het lipopolysaccharide O-antigen van het celoppervlak. Echter, slechts 2 serogroepen, O1 en O139, hebben epidemie of pandemische potentieel ^{1 , 2} getoond. Bovendien is serogroep O139 voornamelijk geïsoleerd voor Zuidoost-Azië ^{3 , 4} , terwijl serogroep O1 wereldwijd wordt verspreid. Bovendien kan de O1 serogroep worden verdeeld in 2 hoofdbiotypes: klassiek en El Tor. Het klassieke biotype was verantwoordelijk voor de eerste 6 cholera pandemieS tussen 1817 en 1923. De lopende zevende pandemie is een gevolg van het El Tor biotype, dat het klassieke biotype wereldwijd in de omgeving ^{5 , 6 , 7} heeft verplaatst. Recent zijn er stammen ontstaan ​​die onderscheidende kenmerken bevatten van zowel klassieke als El Tor biotypen ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} en zijn sindsdien El Tor varianten ^{13 , 17 genoemd} . Sommige El Tor varianten hebben verhoogde virulentiecapaciteiten aangetoond met een snellere en ernstige ziekteprogressie dan eerder waargenomen, onderstrepenDe behoefte aan een meer omvattende aanpak van agentidentificatie en preventie en behandeling van ziekte ^{8 , 9 , 18} . Terwijl de identificatie van biotype de behandeling niet onmiddellijk dicteert, kunnen verdere ontwikkelingen in vaccinontwikkeling en toekomstige therapeutische middelen profiteren van biotype onderscheid.

De eerste reeks protocollen die hier worden vermeld, zullen de onderzoekers in staat stellen V te behouden. Cholerae stammen in een laboratorium omgeving. Consistentie en daaropvolgende analyse vereist voorraadbereiding en groei van isolaten, die niet biotype afhankelijk zijn. Om de virulentie-expressie optimaal te stimuleren, zijn echter onafhankelijke biotype-specifieke cultiveringsmethoden vereist. ¹⁹ . Daarnaast worden voorbereidingen voor diverse genetische en biochemische analyses beschreven in dit manuscript.

Cholera toxine (CT) en de toxine co-reGeulate pilus (TCP) zijn twee belangrijkste virulentie factoren die worden geregeld door de master regulator ToxT in beide biotypen van de V. Cholerae O1 serogroep ²⁰ . CT is een twee-deeltjes toxine samengesteld uit vijf CtxB Subeenheden die een enkele CtxA subeenheid omringen en verantwoordelijk zijn voor het snelle elektrolytverlies geassocieerd met cholera. TCP is een type IV pilus gecodeerd door de tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ), en is betrokken bij de bevestiging en kolonisatie van de distale dunne darm. TcpA is het eerste gen van de tcp operon die codeert voor de individuele pilin subunits die essentieel zijn voor de constructie van de pilus ⁸ . De gensequentie voor ctxA is volledig geconserveerd tussen klassieke en El Tor- biotypen , terwijl ctxB en tcpA verschillen over de twee biotypes, maar worden bewaard binnen elk biotype ⁸ . CtxB is volledig bewaard tussen biotypes, behalve bij twee basisposi(115 en 203). In het El Tor biotype woont thymine bij basisposities 115 en 203, terwijl het klassieke biotype cytosine bij deze basen bevat. TcpA is volledig bewaard binnen elk biotype, maar verschilt op meerdere bases tussen biotypes. Deze genetische onderscheidingen dienen als primaire biotype identificatiemarkers, en na sequencing van het polymerase kettingreactie (PCR) amplificatieproduct omvattende deze sites kunnen isolate sequenties worden vergeleken met wildtype (WT) klassieke O395 of WT El Tor N16961 om de biotype achtergrond te bepalen Van respectievelijk CT en TCP, in een gegeven V. cholerae isolaat.

Er zijn veel protocollen ontwikkeld om de fenotypische onderscheidingen te karakteriseren tussen de klassieke en El Tor biotypes ^{21 , 22 , 23} . Polymyxine B is een peptide antibioticum dat de integriteit van het buitenste celmembraan in Gram-negatieve bac compromiseertTeria en polymyxine B resistentie kunnen worden weergegeven door middel van de polymyxine B resistentie assay ²¹ . Citraat is een primaire substraat van de Kreb-cyclus, en het vermogen om citraat te metaboliseren als enige koolstofbron kan worden bepaald met behulp van de citraatmetabolisme-analyse ²² . HapR codeert voor een globale regulator en de master quorum sensing regulator in V. cholerae, HapR, die bindt aan verschillende promotor regio's en regelt gen- en operon expressie ²⁴ . Sommige pathogene stammen van V. cholerae hebben een natuurlijk voorkomende frame-shift mutatie in het hapR gen dat heeft geleid tot deze dichtheidsafhankelijke regulering van de virulentie genuitdrukking ^{24 , 25} verloren gaan. Het meten van HapR-gereguleerde protease-activiteit met behulp van melkagaremedia laat de onderzoeker toe om te bepalen of een specifiek isolaat een functionele HapR ^{23 bevat} . DeHemolyse assay tests voor het vermogen van een stam hemolytische enzymen af ​​te scheiden die rode bloedcellen lichten; De mate van hemolyse kan worden weergegeven op bloed agarplaten ²³ . Motiliteit wordt vaak geassocieerd met virulentie in V. cholerae en kan geanalyseerd worden met behulp van motiliteitsagarplaten ²³ . De Voges-Proskauer test test voor het vermogen van glucose om glucose als een koolstofbron te fermenteren en de bijproduct acetoïne ^{21 te} produceren. Met de opkomst van El Tor varianten is het moeilijk om de resultaten van een gegeven fenotypische test te voorspellen zonder uitgebreid genotype screening en voordat de biotype achtergrond van V wordt afgetrokken. Cholerae isolaten, wordt het aanbevolen dit samenstel van analyses ²³ uit te voeren en de resultaten te vergelijken met referentiestammen zoals in Tabel 2 .

Hierin hebben we een reeks protocollen geavanceerd, die collectief gebruik maken van de aforemNtioned genotypische en fenotypische analyses voor een meer uitgebreide aanpak om V te karakteriseren. Cholerae biotypes. Verder hebben we de genotypische en fenotypische onderscheidingen van bekende V beschreven. Cholerae El Tor varianten (MQ1795 en BAA-2163), in vergelijking met veelgebruikte biotype referentiestammen (WT klassieke O395, WT El Tor C6706 en WT El Tor N16961; Tabel 1 ). De opkomst van El Tor varianten heeft uitdagingen voorgedragen aan de betrouwbaarheid van eerder gebruikte single-assay biotype karakterisering protocollen; Dit multiple assay identificatie systeem zal echter toelaten voor betrouwbare karakterisering van klinische en milieu V. Cholerae isolaten.