Técnicas de laboratório usadas para manter e diferenciar biótipos de<em> Vibrio cholerae</em> Isolados clínicos e ambientais

A cólera é uma doença do intestino delgado distal causada pelo consumo de alimentos contaminados ou água contendo a bactéria Gram-negativa Vibrio cholerae aquática. Os sintomas da cólera incluem vômitos e diarréia aquosa incontrolável, levando a desidratação severa, que, se não for tratada adequadamente, resultará em morte. V. Cholerae pode ser dividido em mais de 200 serogrupos com base na estrutura do antígeno O de lipopolissacarídeo de superfície celular. No entanto, apenas 2 sorogrupos, O1 e O139, mostraram potencial epidêmico ou pandêmico ^{1 , 2} . Além disso, o serogrupo O139 foi isolado principalmente no Sudeste Asiático ^{3 , 4} , enquanto o serogrupo O1 está distribuído em todo o mundo. Além disso, o sorogrupo O1 pode ser dividido em 2 biótipos principais: clássico e El Tor. O biótipo clássico foi responsável pela primeira pandemia de cólera 6Entre 1817 e 1923. A sétima pandemia em curso é resultado do biótipo El Tor, que deslocou globalmente o biótipo clássico no ambiente ^{5 , 6 , 7} . Recentemente, surgiram tensões que contêm características distintivas dos biótipos clássicos e El Tor ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} e desde então foram denominadas variantes ^{13 , 17 de} El Tor. Algumas variantes de El Tor demonstraram capacidades de virulência elevadas com progressão de doença mais rápida e grave do que a observada anteriormente, enfatizandoA necessidade de uma abordagem mais abrangente para identificação de agentes e prevenção e tratamento de doenças ^{8 , 9 , 18} . Embora a identificação do biótipo não dê de imediato o tratamento, os avanços no desenvolvimento da vacina e nos futuros agentes terapêuticos podem beneficiar da distinção biótipo.

A primeira série de protocolos listados aqui permitirá que os investigadores mantenham corretamente V. Cepas de cólera em um ambiente de laboratório. Consistência e análise subseqüente requerem a preparação de estoque e o crescimento de isolados, o que não é biótipo-dependente. No entanto, para induzir de forma otimizada a expressão de genes de virulência, são necessárias técnicas de cultura de bioótipo independentes ¹⁹ . Além disso, a preparação para vários ensaios genéticos e bioquímicos é descrita neste manuscrito.

A toxina da cólera (CT) e a toxina co-rePilula gulosa (TCP) são dois principais fatores de virulência controlados pelo regulador mestre ToxT em ambos biótipos do V. Serogrupo ^{20 de} cholerae O1. CT é uma toxina bipartida composta por cinco CtxB Subunidades envolvendo uma única subunidade CtxA, e é responsável pela perda rápida de eletrólito associada à cólera. TCP é um pilus tipo IV codificado pelo operão tcp ( tcpABQCRDSTEF ), e está envolvido na fixação e colonização do intestino delgado distal. TcpA é o primeiro gene do operão tcp que codifica as subunidades individuais de pilina essenciais para a construção do pilus ⁸ . A sequência de genes para ctxA é completamente conservada entre biótipos clássicos e El Tor, enquanto ctxB e tcpA diferem entre os dois biótipos, mas são conservados dentro de cada biótipo ⁸ . CtxB é completamente conservado entre biótipos, exceto em dois pontos básicos(115 e 203). No biótipo de El Tor, a timina reside nas posições de base 115 e 203, enquanto o biótipo clássico contém citosina nestas bases. TcpA é completamente conservado dentro de cada biótipo, mas diferem em bases múltiplas entre biótipos. Essas distinções genéticas servem como marcadores primários de identificação de biótipo e, depois de seqüenciar o produto de amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), incluindo esses locais, as seqüências isoladas podem ser comparadas com O395 ou WT El Tor N16961 de tipo selvagem (WT) para determinar o fundo do biótipo De CT e TCP, respectivamente, em um isolado de V. cholerae .

Numerosos protocolos foram desenvolvidos para caracterizar as distinções fenotípicas entre os biótipos clássicos e El Tor ^{21 , 22 , 23} . A polimixina B é um antibiótico peptídico que compromete a integridade da membrana celular externa em bactérias Gram-negativasE a resistência à polimixina B podem ser visualizadas através do ensaio de resistência à polimixina B ²¹ . O citrato é um substrato primário do ciclo do Kreb e a capacidade de metabolizar o citrato como única fonte de carbono pode ser determinada utilizando o ensaio de metabolismo de citrato ²² . HapR codifica um regulador global e o regulador mestre de sensor de quorum em V. cholerae, HapR, que se liga a várias regiões promotoras e regula a expressão de genes e operões ²⁴ . Algumas cepas patogênicas de V. cholerae têm uma mutação de mudança de quadro natural no gene hapR que causou a perda da densidade da expressão de genes da virulência ^{24 , 25} . Medir a atividade de protease regulada por HapR usando meios de agar de leite permite ao pesquisador identificar se um isolado particular contém um HapR ²³ funcional. oTestes de análise de hemólise para a capacidade de uma cepa de secretar enzimas hemolíticas que lisam glóbulos vermelhos; O grau de hemólise pode ser visualizado em placas de agar de sangue ²³ . A mobilidade é freqüentemente associada à virulência em V. cholerae e pode ser analisada usando placas de ágar de motilidade ²³ . O teste de Voges-Proskauer prova a capacidade de uma cepa para fermentar a glicose como única fonte de carbono e produzir o acetato de subproduto ²¹ . Com o surgimento de variantes de El Tor, é difícil prever os resultados de qualquer teste fenotípico dado sem rastreio genotípico extensivo e antes de deduzir o fundo biótipo de V. Isolados de cholerae , recomenda-se a realização desta montagem de ensaios ²³ e compare os resultados com as cepas de referência como na Tabela 2 .

Aqui, avançamos uma série de protocolos, utilizando coletivamente o referidoEnsaios fenotípicos e fenotípicos referentes a uma abordagem mais abrangente para a caracterização de V. Biótipos de cólera . Além disso, descrevemos as distinções genotípicas e fenotípicas do V conhecido. Variantes de cholerae El Tor (MQ1795 e BAA-2163), em comparação com as estirpes de referência de biótopos comummente usadas (WT clássico O395, WT El Tor C6706 e WT El Tor N16961, Tabela 1 ). O surgimento de variantes de El Tor apresentou desafios à confiabilidade de protocolos de caracterização de bióto simples de ensaio previamente empregados; No entanto, este sistema de identificação de múltiplos ensaios permitirá uma caracterização mais confiável do V clínico e ambiental. Isolados de cólera .