Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di<em> Vibrio cholerae</em> Isolati clinici ed ambientali

Il colera è una malattia dell'intestino tenue distale causata dal consumo di alimenti contaminati o di acqua contenente il batterio Gram-negativo acquatico Vibrio cholerae . I sintomi del colera includono vomito e diarrea acquosa incontrollabile, portando ad una grave disidratazione che, se non trattata correttamente, provocherà la morte. V. Il colerae può essere diviso in oltre 200 serogruppi basati sulla struttura del lipopolysaccharide O-antigene della superficie cellulare. Tuttavia, solo 2 serogruppi, O1 e O139, hanno mostrato potenziale epidemico o pandemico ^{1 , 2} . Inoltre, il serogroup O139 è stato principalmente isolato per l'Asia sud-orientale ^{3 , 4} , mentre il sierogruppo O1 è distribuito in tutto il mondo. Inoltre, il serogroupo O1 può essere diviso in 2 biotipi principali: classici e El Tor. Il biotipo classico era responsabile delle prime 6 pandemie del coleraTra il 1817 e il 1923. La peggiorata settima pandemia è il risultato del biotipo El Tor, che ha spostato globalmente il biotipo classico nell'ambiente ^{5 , 6 , 7} . Sono stati recentemente presentati ceppi che contengono caratteristiche distintive di biotipi classici e El Tor ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} e da allora sono stati denominati varianti El Tor ^{13 , 17} . Alcune varianti di El Tor hanno dimostrato elevate capacità di virulenza con una progressione più rapida e grave della malattia rispetto a quanto precedentemente osservato, sottolineandoLa necessità di un approccio più completo all'identificazione degli agenti e alla prevenzione e trattamento delle malattie ^{8 , 9 , 18} . Mentre l'identificazione del biotipo non impone immediatamente il trattamento, ulteriori progressi nello sviluppo del vaccino e nei futuri agenti terapeutici possono beneficiare della distinzione tra biotipo.

La prima serie di protocolli elencati qui consentirà agli investigatori di mantenere correttamente V. Ceppi di colera in un ambiente di laboratorio. La coerenza e l'analisi successiva richiedono la preparazione e la crescita degli stock di isolati, che non dipendono dal biotipo. Tuttavia, per indurre in modo ottimale l'espressione genica di virulenza, sono necessarie tecniche indipendenti di coltura biotipo ¹⁹ . Inoltre, la preparazione per diversi dosaggi genetici e biochimici è descritta in questo manoscritto.

Tossina del colera (CT) e la tossina co-re(TCP) sono due principali fattori di virulenza controllati dal regolatore master ToxT in entrambi i biotipi del V. Il colerae O1 sierogruppo ²⁰ . CT è una tossina bipartita composta da cinque CtxB Subunità che circondano una singola subunità CtxA ed è responsabile della rapida perdita di elettroliti associata al colera. Il TCP è un pilone di tipo IV codificato dal tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ) ed è coinvolto nell'attaccamento e nella colonizzazione dell'intestino tenue distale. TcpA è il primo gene dell'operone tcp che codifica le singole subunità piline essenziali per la costruzione del pilus ⁸ . La sequenza genica per ctxA è completamente conservata tra biotipi classici e El Tor, mentre ctxB e tcpA si differenziano tra i due biotipi ma sono conservati all'interno di ciascun biotipo ⁸ . CtxB è completamente conservato tra i biotipi ad eccezione di due posi base(115 e 203). Nel biotipo El Tor, la timina risiede nelle posizioni base 115 e 203, mentre il biotipo classico contiene citosina a queste basi. TcpA è completamente conservato all'interno di ogni biotipo, ma differisce da molteplici basi tra biotipi. Queste distinzioni genetiche servono come marcatori di identificazione biotipo primari, e dopo la sequenza del prodotto di amplificazione della reazione di polimerasi (PCR), inclusi questi siti, le sequenze di isolamento possono essere confrontate con il classico O395 o WT El Tor N16961 di tipo wild (WT) per determinare lo sfondo del biotipo Di CT e TCP rispettivamente, in un dato isolamento di V. cholerae .

Numerosi protocolli sono stati sviluppati per caratterizzare le distinzioni fenotipiche tra i biotipi classici e El Tor ^{21 , 22 , 23} . Polimicina B è un antibiotico peptidico che compromette l'integrità della membrana cellulare esterna in bacTeria e la resistenza alla polimicina B possono essere visualizzati attraverso il saggio di resistenza della polimigina B ²¹ . Il citrato è un substrato primario del ciclo di Kreb, e la capacità di metabolizzare il citrato come fonte di carbonio unica può essere determinata usando il saggio del metabolismo citrato ²² . HapR codifica un regolatore globale e il regolatore di sensori quorum master in V. cholerae, HapR, che si lega a varie regioni del promotore e regola l'espressione del gene e dell'operone ²⁴ . Alcuni ceppi patogeni di V. cholerae hanno una mutazione in movimento naturale nel gene hapR che ha causato la perdita di questa regolazione dipendente dalla densità dell'espressione genetica di virulenza ^{24 , 25} . La misurazione dell'attività di proteasi regolata da HapR utilizzando il supporto agarico del latte permette al ricercatore di identificare se un particolare isolato contiene un HapR ²³ funzionale. IlI test di hemolysis per una capacità del ceppo di secernere enzimi emolitici che lissano i globuli rossi; Il grado di emolisi può essere visualizzato sulle piastre di agar sangue ²³ . La motilità è spesso associata alla virulenza di V. cholerae e può essere analizzata usando le piastre agarico agar ²³ . Il test Voges-Proskauer esamina la capacità di uno strain di fermentare il glucosio come una sola fonte di carbonio e produrre l'acetoina sottoprodotto ²¹ . Con l'emergere di varianti di El Tor, è difficile prevedere i risultati di un determinato dosaggio fenotipico senza estesa screening genotipica e prima di dedurre lo sfondo biotipo di V. Isolati di colerae, si raccomanda di eseguire questo insieme di dosaggi ²³ e confrontare i risultati con i ceppi di riferimento come nella tabella 2 .

In questo contesto, abbiamo avanzato una serie di protocolli, utilizzando collettivamente l'aforemeI test genotipici e fenotipici per un approccio più completo alla caratterizzazione di V. Biotipi di colera. Inoltre, abbiamo descritto le distinzioni genotipiche e fenotipiche del V noto. Varianti del colerae El Tor (MQ1795 e BAA-2163), rispetto ai ceppi di riferimento di biotipo comunemente usati (WT classico O395, WT El Tor C6706 e WT El Tor N16961, Tabella 1 ). L'emergere di varianti El Tor ha presentato sfide all'affidabilità dei protocolli di individuazione biotipo di singolo dosaggio precedentemente impiegati; Tuttavia, questo sistema di identificazione multipla consentirà una caratterizzazione più affidabile dei criteri clinici e ambientali. Isolati di colera .