Лабораторные методы, используемые для поддержания и дифференциации биотипов<em> Vibrio cholerae</em> Клинические и экологические изоляты

Холера – это заболевание дистального тонкого кишечника, вызванное потреблением загрязненной пищи или воды, содержащей водную грамотрицательную бактерию Vibrio cholerae . Симптомы холеры включают рвоту и неконтролируемую водянистую диарею, что приводит к серьезному обезвоживанию, которое, если его не лечить должным образом, приведет к смерти. V. Холеру можно разделить на более чем 200 серогрупп, основанных на структуре O-антигена липополисахарида клеточной поверхности. Однако только 2 серогруппы O1 и O139 продемонстрировали эпидемический или пандемический потенциал ^{1 , 2} . Более того, серогруппа O139 была в основном изолирована от Юго-Восточной Азии ^{3 , 4} , а серогруппа O1 распределена во всем мире. Кроме того, серогруппу O1 можно разделить на 2 основных биотипа: классический и El Tor. Классический биотип отвечал за первые 6 пандемий холерыС 1817 по 1923 год. Продолжающаяся седьмая пандемия является результатом биотипа Эль-Тор, который во всем мире смещает классический биотип в окружающую среду ^{5 , 6 , 7} . Недавно возникли штаммы, которые содержат отличительные характеристики как классических, так и биотипов El Tor ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} и с тех пор назывались вариантами El Tor ^{13 , 17} . Некоторые варианты El Tor продемонстрировали повышенную способность вирулентности с более быстрым и тяжелым прогрессированием заболевания, чем ранее наблюдалось, подчеркиваяНеобходимость более комплексного подхода к идентификации агентов и профилактике и лечению болезней ^{8 , 9 , 18} . Хотя идентификация биотипа не сразу диктует лечение, дальнейшие улучшения в развитии вакцины и будущих терапевтических агентах могут выиграть от различия биотипов.

Первая серия протоколов, перечисленных здесь, позволит исследователям правильно поддерживать V. Штаммов холеры в лабораторных условиях. Последовательность и последующий анализ требуют подготовки запасов и роста изолятов, которые не зависят от биотипа. Однако для оптимального индуцирования экспрессии генов вирулентности необходимы независимые биотипические методы культивирования ¹⁹ . Кроме того, в этой рукописи изложена подготовка к различным генетическим и биохимическим анализам.

Толерант холеры (КТ) и токсин co-reGulated pilus (TCP) – два основных фактора вирулентности, контролируемых главным регулятором ToxT в обоих биотипах V. Cholerae O1 серогруппа ²⁰ . CT – двудольный токсин, состоящий из пяти CtxB Субъединиц, окружающих одну субъединицу CtxA, и отвечает за быструю потерю электролита, связанную с холерой. TCP является типом IV пилота, закодированным операндом tcp ( tcpABQCRDSTEF ), и участвует в прикреплении и колонизации дистального тонкого кишечника. TcpA является первым геном оперона tcp , который кодирует отдельные субъединицы пилина, необходимые для построения пилюса ⁸ . Последовательность генов для ctxA полностью сохраняется между классическими и биотипами El Tor, тогда как ctxB и tcpA различаются по двум биотипам, но сохраняются в каждом биотипе ⁸ . CtxB полностью сохраняется между биотипами, за исключением двух базовых позиций(115 и 203). В биотипе El Tor тимин находится в базовых положениях 115 и 203, тогда как классический биотип содержит цитозин на этих основаниях. TcpA полностью сохраняется в каждом биотипе, но отличается на нескольких основаниях между биотипами. Эти генетические различия служат в качестве первичных идентификационных маркеров биотипа, и после секвенирования продукта амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающего эти сайты, изолятные последовательности можно сравнить с классическим классическим O395 дикого типа (WT) или WT El Tor N16961 для определения фона биотипа CT и TCP, соответственно, в данном изоляте V. cholerae .

Разработаны многочисленные протоколы для описания фенотипических различий между классическими и биотипами El Tor ^{21 , 22 , 23} . Полимиксин В представляет собой пептидный антибиотик, который ставит под угрозу целостность наружной клеточной мембраны в грамотрицательном бакеТерия и полимиксина В можно визуализировать с помощью анализа резистентности к полимиксину В ²¹ . Цитрат является основным субстратом цикла Креба, и способность метаболизировать цитрат в качестве единственного источника углерода может быть определена с использованием анализа метаболизма цитрата ²² . HapR кодирует глобальный регулятор и главный регулятор кворума в V cholerae, HapR, который связывается с различными областями промотора и регулирует экспрессию гена и оперона ²⁴ . Некоторые патогенные штаммы V. cholerae имеют естественную мутацию смены кадров в гене hapR , что привело к потере этой зависимой от плотности регуляции экспрессии гена вирулентности ^{24 , 25} . Измерение активности протеазы, регулируемой HapR, с использованием молочных агаровых сред позволяет исследователю определить, содержит ли конкретный изолят функциональный HapR ²³ .Анализы гемолиза для определения способности штамма выделять гемолитические ферменты, которые лизят эритроциты; Степень гемолиза может быть визуализирована на пластинах ²³ агара. Подвижность часто ассоциируется с вирулентностью у V. cholerae и может быть проанализирована с использованием пластинчатых агаровых пластин ²³ . Анализ Voges-Proskauer проверяет способность штамма ферментировать глюкозу в качестве единственного источника углерода и продуцировать ацетоин побочного продукта ²¹ . С появлением вариантов El Tor трудно предсказать результаты любого данного фенотипического анализа без обширного генотипического скрининга и до выведения биотипического фона V. Холеры, рекомендуется выполнить эту сборку анализов ²³ и сравнить результаты с ссылочными штаммами, как в таблице 2 .

В этой связи мы разработали ряд протоколов, совместно использующих aforemeГенотипических и фенотипических анализов для более полного подхода к характеристике V. Холерные биотипы. Кроме того, мы описали генотипические и фенотипические различия известных V. Cholerae El Tor (MQ1795 и BAA-2163) по сравнению с обычно используемыми ссылочными штаммами биотипов (классический WT классический O395, WT El Tor C6706 и WT El Tor N16961, таблица 1 ). Появление вариантов El Tor показало проблемы надежности ранее использованных протоколов характеризации биотипа одного анализа; Однако эта система идентификации с множественным анализом позволит обеспечить более надежную характеристику клинического и экологического V. Изолятов холеры .