JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Glycoproteoomanalyses van de extracellulaire matrix: Een methode voor Intact Glycopeptide analyse met behulp van massaspectrometrie

Published: April 21, 2017
doi:
10.3791/55674
, , , ,
1King’s British Heart Foundation Centre,King’s College London

Summary

Dit artikel beschrijft een methode cardiovasculaire weefselmonsters voor MS analyse mogelijk maakt (1) de analyse van ECM eiwitsamenstelling, (2) het identificeren van glycosyleringsplaatsen, en (3) de samenstelling karakterisering van glycan vormen moeten worden bereid. Deze methodologie kan worden toegepast, met kleine modificaties, voor de studie van de ECM in andere weefsels.

Abstract

Fibrose is een kenmerk van vele hart- en vaatziekten, geassocieerd met de secretie verergerd en afzetting van extracellulaire matrix (ECM). Met behulp van proteomics, hebben we eerder geïdentificeerd meer dan 150 ECM en ECM-geassocieerde eiwitten in cardiovasculaire weefsels. Met name zijn veel ECM eiwitten geglycosyleerd. Deze posttranslationele modificatie invloed eiwitvouwing, oplosbaarheid, binding en degradatie. We hebben een sequentiële extractie en verrijking werkwijze voor ECM proteïnen die compatibel is met de volgende vloeistof chromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) analyse van intacte glycopeptiden is ontwikkeld. De strategie is gebaseerd op achtereenvolgende incubaties met NaCl, SDS weefsel ontcelling en guanidinehydrochloride voor het oplosbaar maken van ECM eiwitten. Recente ontwikkelingen in LC-MS / MS fragmentatie werkwijzen omvatten, zoals combinaties van hogere energie collision dissociatie (HCD) en elektronoverdracht dissociatie (ETD), die het mogelijk makende samenstelling directe analyse van glycopeptiden van ECM eiwitten. In dit document beschrijven we een methode om de ECM uit weefselmonsters te bereiden. De werkwijze maakt niet alleen proteïneprofilering maar ook de evaluatie en karakterisering van glycosylering door MS analyse.

Introduction

Fibrosis is een kenmerk van vele ziekten. Fibroblasten prolifereren en differentiëren tot zeer synthetische fenotypen die zijn geassocieerd met de verergerd secretie van extracellulaire matrix (ECM) 1. Overmatige ECM afzetting kan blijven, zelfs na de eerste schade heeft afgenomen, wat leidt tot functionele beperking. Via proteoom, hebben we eerder geïdentificeerd meer dan 150 ECM en ECM-geassocieerde eiwitten in hartweefsel 2, 3. Ze zijn niet alleen structurele eiwitten, maar ook matricellulaire eiwitten en proteases die bijdragen aan de continue verbouwing en dynamische aanpassing van het hart. Met name zijn veel ECM eiwitten geglycosyleerd 4. Deze post-translationele modificatie (PTM) bij de bereiding suikerresiduen bepaalde aminozuurposities, en raakt eiwitvouwing, oplosbaarheid, binding en degradatie 5 </sup>.

Er zijn twee belangrijke glycosylering soorten die voorkomen in zoogdieren. (1) N-glycosylering plaatsvindt bij het stikstofatoom carboxamido asparagine residuen (Asn) in de consensussequentie Asn-Xaa-Thr / Ser, waarbij Xaa elk aminozuur behalve proline. (2) in O-glycosylatie, suikerresten hechten aan serine- en threonine-residuen (Ser, Thr) of, in veel mindere mate, hydroxyproline en hydroxylysine. Terwijl O-glycosylering kan op diverse proteïnegroepen, N-glycosylering beperkt tot gesecreteerde eiwitten of extracellulaire domeinen van membraaneiwitten 5. Dit maakt N-glycosylering een aantrekkelijk doelwit bij het bestuderen van de ECM.

Proteomics zet een nieuwe standaard voor de analyse van eiwit veranderingen bij de ziekte. Tot nu toe zijn de meeste proteomics studies gericht op intracellulaire eiwitten 6. Dit is voornamelijk te wijten aan de volgende redenen. Ten eerste, overvloedige intracellulaire eiwitten bemoeilijken de identificatiecatie van schaarse ECM componenten. Dit is met name belangrijk in hartweefsel, waarbij mitochondriale en myofilament eiwitten voor een groot deel van het proteïnegehalte 7. Ten tweede, integraal ECM eiwitten zijn sterk verknoopt en moeilijk te lossen. Tenslotte de aanwezigheid van overvloedige PTMs (bijvoorbeeld glycosylatie) verandert de moleculaire massa, lading en elektroforetische eigenschappen van peptiden, die zowel de scheiding en identificatie van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS). In de afgelopen jaren, hebben we ontwikkeld en verbeterd een sequentiële extractie en verrijking methode voor het ECM-eiwitten die compatibel zijn met latere analyse massaspectrometrie (MS) is. De strategie is gebaseerd op opeenvolgende incubaties.

De eerste stap wordt uitgevoerd met NaCl, een ionische buffer die de extractie van ECM-geassocieerde losjes gebonden ECM proteïnen, evenals nieuw gesynthetiseerde ECM eiwitten vergemakkelijkt. Het is wasmiddel zonder, niet-denaturerend, niet verstorend van celmembranen en vatbaar voor verdere biochemische assays 8. Vervolgens wordt ontcelling bereikt met natriumdodecylsulfaat (SDS). Bij deze stap een lage SDS-concentratie zorgt membraan destabilisatie en het vrijkomen van intracellulaire eiwitten, terwijl het voorkomen van verstoring van de meer oplosbare niet-integrale ECM componenten. Tenslotte worden ECM proteïnen geëxtraheerd met guanidinehydrochloride buffer (GuHCl). GuHCl is effectief bij het extraheren van sterk verknoopte proteïnen en proteoglycanen uit weefsels zoals pezen 9, 10 kraakbeen, vaten 11, 12, 13 en het hart 2, 3. We pasten deze biochemische fractionering, in combinatie met LC-MS / MS, om ECM remodeling in hart- en vaatziekten 2 te verkennen <sup>, 3, 11, 12, 13, 14. Recente ontwikkelingen in MS omvatten nieuwe fragmentatiemethoden, zoals combinaties van hogere energie collision dissociatie (HCD) en elektronoverdracht dissociatie (ETD), die tegen de rechtstreekse analyse van intacte glycopeptiden 3, 15.

Hier beschrijven we een methode ECM bereiden MS analyse dat analyse mogelijk maakt van eiwitsamenstelling, de identificatie van glycosylatieplaatsen en de karakterisering van glycan vormen. In vergelijking met eerdere analyses van ECM glycosylering 16 Deze methode maakt de directe beoordeling van compositionele veranderingen in glycosyleringsprofielen een plaatsspecifieke wijze met behulp van MS. We hebben deze methode toegepast op cardiovasculaire weefsels. Het kan echter alzodanig zijn aangebracht, met geringe modificaties, voor de studie van de ECM in andere weefselmonsters en kan ongekende inzichten in ECM biologie leveren.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de lokale Research Ethics Committee Wandsworth (referentienummer: 06 / Q0803 / 37) en ontving institutionele goedkeuring van het kantoor van onderzoek en ontwikkeling. Alle patiënten gaven schriftelijk informed consent. 1. Extractie van extracellulaire matrix LET OP: De menselijke atriale weefsels gebruikt voor deze experimenten werden verkregen uit de atriale appendages tijdens cardiopulmonale bypass, net na de cardioplegie arrestatie van het hart. Alle monsters werden verzameld op St George's Hospital, London, UK. Alle weefselmonsters worden ingevroren bij -80 ° C. Gebruik geen monsters geconserveerd met fixatieven, zoals paraformaldehyde, dat verknopen eiwitten. Bereid alle extractiebuffers vóór experimenten volgens tabel 1, teneinde de tijd tussen de extractiestappen minimaliseren. Voer alle incubaties bij kamertemperatuur (RT) in een temperatuur gecontroleerde omgeving(Dwz, ~ 20 ° C) om de samenhang tussen extracties waarborgen. Weeg 20-50 mg weefsel. Indien meerdere monsters worden onttrokken, gesneden en gewogen één voor één de volledige ontdooien van het weefsel te voorkomen. Met behulp van een scalpel, snijd het weefsel in 3-4 kleinere stukken (bijvoorbeeld 2-3 mm) en plaats ze samen in 1,5 ml buizen. Voeg 500 ul ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; zie Tabel 1 en Tabel Materials) en voer vijf wassingen bloed besmetting te minimaliseren. Extractie Stap 1: Incubatie met NaCl buffer Na wassen met PBS, plaatst de monsters in 1,5 ml buizen met schroefdoppen. Voeg NaCl buffer (zie tabel 1) 10 maal (v: g) het weefselgewicht. Vortex de buizen bij kamertemperatuur gedurende 1 h bij minimumsnelheid (dwz, 600 rpm). OPMERKING: Een lage draaikolk snelheid is van cruciaal belang voor de mechanische verstoring van het weefsel tijdens deze stap te vermijden.Met een schuim aan op alle buizen te plaatsen tijdens de extractie. Breng de nieuwe extracten en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Bewaar de extracten bij -20 ° C tot gebruik. Kort samengevat was het restmateriaal pellets met verse NaCl buffer. Met hetzelfde type buffer (dat wil zeggen, 100 pl buffer NaCl) voor het wassen om de extractie van andere eiwitten met verschillende oplosbaarheden (dwz eiwitten niet extraheerbaar met NaCl) te voorkomen. Na wassen, zorgen voor de volledige verwijdering van de buffer om overlappingen eiwitgehalte met daaropvolgende extractiestappen minimaliseren. Gooi de NaCl-buffer gebruikt voor het wassen. OPMERKING: De verhouding tussen het buffervolume en het gewicht weefsel belangrijk voor een reproduceerbare extractie. A 10: 1 verhouding (v: w) voor NaCl en SDS extracties en 5: 1 van de GuHCl stap voldoende hoeveelheden eiwitten zonder verzadiging van de buffer. Eiwitconcentraties ongeveer 1-2 ug / ul na extraction. Extractie Stap 2: Decellularisatie SDS buffer Voeg SDS-buffer (Tabel 1) bij tienmaal (v: g) het weefselgewicht; het gebruik van lage concentraties SDS (dwz 0,1%) is essentieel voor het verlies van ECM eiwitten in cellen ontdoen voorkomen. Vortex de buizen bij kamertemperatuur gedurende 16 h bij minimumsnelheid (dwz, 600 rpm). OPMERKING: Een lage draaikolk snelheid minimaliseert mechanische verstoring van de ECM. Breng de extracten om nieuwe buizen. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C; bewaren bij -20 ° C tot gebruik. Kort samengevat was het restmateriaal pellets met dd H2O het SDS te verwijderen. Zorgen voor de volledige verwijdering van de vloeistof na het wassen. Extractie Stap 3: Incubatie met GuHCl Buffer Voeg GuHCI buffer (Tabel 1) en vijf maal (v: g) het weefselgewicht. Vortex de buizen bij kamertemperatuur gedurende 72 h bij maximumsnelheid (dwz </em> 3.200 rpm); krachtig wervelen vergemakkelijkt de mechanische verstoring van de ECM. Breng de extracten om nieuwe buizen. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. 2. Eiwit kwantificeren en neerslag Opmerking: Door de aanwezigheid van detergentia, het SDS buffer verenigbaar met directe kwantificering eiwit op basis van metingen van de absorptie bij 280 nm. Reproduceerbare kwantificering garanderen, gebruiken colorimetrische assays voor eiwitextracten 17. Kwantificering. Bereid normen voor een kalibratiekromme met boviene serum albumine (BSA) serieel verdund in het juiste extractiebuffer (bijvoorbeeld NaCl, SDS of GuHCl) 17. Gedurende deze tijd, dooi de monsterextracten. Verdun de monsters in extractiebuffer concentraties binnen verkrijginghet lineaire bereik van de absorptie; een 1:10 verdunning (v: v) levert bevredigende resultaten. Verdun het GuHCI monsters met een gelijke hoeveelheid DDH 2 O tot kwantificering als het colorimetrische assay is niet compatibel met concentraties> 4 M GuHCl. Gebruik een bicinchoninezuur (BCA) gebaseerde colorimetrische bepaling 17 (zie tabel of Materials), volgens de instructies van de fabrikant voor assays in 96-putjesplaten; is het raadzaam om ten minste duplo metingen uit te voeren. Na incubatie gedurende 30 min, neem absorptiemetingen bij een golflengte van 570 nm teneinde de eiwitconcentratie met de BSA standaardkalibratiecurve 17 te berekenen. eiwit Neerslag Dooi GuHCI extracten bij kamertemperatuur. Aliquot 10 ug eiwit per monster in nieuwe buisjes. Voor direct glycopeptide analyse portie 50 ug. Voeg 10 maal het volume van ethanol en Incuverminder overnacht bij -20 ° C. LET OP: GuHCl is niet compatibel met verdere enzymatische reacties en de meeste elektroforetische toepassingen. Het verwijderen van GuHCl is vereist voordat deglycosyleren en trypsine spijsvertering. De oplosbaarheid van GuHCl in ethanol en, omgekeerd, de geringe oplosbaarheid van eiwitten voor een doeltreffende verwijdering van GuHCl terwijl hetgeen ongeveer 98% terugwinning van eiwitten 18. Centrifugeer de monsters bij 16.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en zuig de supernatant. Zorg ervoor dat u de neergeslagen pellet te verstoren. Droog de pellets gedurende 15 min met een vacuümconcentrator (zie tabel materiaalkunde) bij KT. Opmerking: Het protocol kan hier worden gestopt en de gedroogde korrels bewaard bij -20 ° C tot gebruik. Eventueel lopen een gelelektroforese kwaliteitscontrole (QC, zie Supplemental Methods). 3. Sequentiële Deglycosylatie deBeoordeling van de N-glycosylering Site bezetting Tijdens sample droging (zie stap 2.2.2), bereid de deglycosylatie buffer bevattende onttakkende deglycosylatie enzymen, zoals in tabel 1. Zie tabel van materialen voor product details. Voeg 10 ul van deglycosylatie buffer bevattende enzymen aan elk monster. Zorg ervoor dat de juiste pellet resuspensie door het uitvoeren van een snelle vortex en spin-neer van monsters. Opmerking: Het verwijderen van suiker monomeren gebruikt debranching enzymen die essentieel is voor de verdere en volledige verwijdering van O-gekoppelde complexe sacchariden en vergemakkelijkt het latere splitsing van N-gekoppelde suikers met PNGase-F. Incubeer gedurende 2 uur bij 25 ° C om de verwijdering van heparansulfaat door heparinase II.Increase de temperatuur tot 37 ° C en incubeer gedurende 36 uur onder zacht schudden. OPMERKING: Gezien het lage reactievolumes en langere incubatietijden, gebruik incubator shakers en strak verpakken meervoudige 1,5 ml tubes in een 50 ml conische buis leunt in de couveuse ongeveer 45 °. Na 36 uur centrifugeren van de monsters gedurende 1 minuut bij 16.000 xg en verdampen van het H2O uit de monsters onder toepassing van een concentrator vacuüm bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 45 minuten. Resuspendeer de gedroogde monsters van 10 ul van H2 18 O bevattende 50 U / ml PNGase-F, die splitst alle asparagine-gekoppelde glycanen in een deamidatie reactie. Opmerking: De resulterende asparaginezuur draagt ​​een overmaat massa van 2,98 Da, indicatief voor de aanwezigheid van N-glycosylatie in MS-analyse. Incubeer gedurende 36 uur bij 37 ° C onder constant roeren in de incubator schudinrichting. 4. oplossing Trypsine Spijsvertering Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd voor zowel niet-gedeglycosyleerd (dwz voor directe glycopeptide analyse) en gedeglycosyleerde monsters (dat wil zeggen, voor de beoordeling van glycan occupancy). Met 10 pg totaal eiwit voor de evaluatie van N-glycosyleringsplaats bezetting (zoals in de vorige stap). Voor monsters voor directe glycopeptide analyse gebruik 50 ug eiwit als uitgangshoeveelheid. OPMERKING: De volgende stappen worden beschreven voor 10 ug eiwit. Opschalen th evolumes (dat wil zeggen, 5 keer voor 50 ug) zoals vereist. Denatureren de eiwitten op elk monster aliquot behulp 9 M ureum en 3 M thioureum, met eindconcentraties van 6 M ureum en 2 M thioureum, respectievelijk (bijvoorbeeld voor een 10 pl monster, 20 pl ureum / thioureum). Vermindering van de eiwitten door toevoeging van 100 mM dithiotreïtol (DTT, 3,33 pl, eindconcentratie: 10 mM). Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur onder roeren bij 240 rpm. Afkoelen van de monsters tot kamertemperatuur alvorens de alkylering door 0,5 M joodaceetamide (3,7 fll, eindconcentratie: 50 mM). Incubeer in het donker gedurende 1 uur. Gebruik pre-gekoeld (-20° C) aceton (6 maal het volume van het monster) aan de monsters overnacht te incuberen bij -20 ° C. Precipiteren door centrifugatie bij 14.000 xg gedurende 25 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant. Zorg ervoor dat u de neergeslagen pellet te verstoren. Droog de pellets eiwit onder gebruikmaking van een vacuümconcentrator gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer in 20 pl 0,1 M triethylammoniumbicarbonaat (TEAB) -buffer, pH 8,2, bevattende trypsine (0,01 ug / ul) en verteren nacht bij 37 ° C en 240 rpm. Stop de vertering door aanzuren van de monsters met 10% trifluorazijnzuur (TFA, 2 pl van een eindconcentratie van 1% TFA). 5. Peptide Cleanup gebruiken C18 kolommen Opmerking: Het verwijderen van storende verontreinigingen uit het peptidemengsel na digestie vermindert ion onderdrukking en verbetert de signaal-ruisverhoudingen en sequentie dekking. Deze stap dient voor zowel niet-gedeglycosyleerde en gedeglycosyleerde sa uitgevoerdmples. Activeer de hars op de C18 draaiplaat (zie tabel of Materials) toepassing van 200 pl per putje methanol en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 minuut. Wassen door toevoeging van 200 pi per putje van 80% acetonitril (ACN) en 0,1% TFA in H2O Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 minuut. Evenwicht door toevoeging van 200 pi per putje van 1% ACN en 0,1% TFA in H2O Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 minuut. Herhaal deze stap nog twee keer. Laad de monsters (het gehele volume) van stap 4 in de putjes met hars en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 1 minuut. Herladen de doorloop nogmaals en herhaal de centrifugatie. Wassen door toevoeging van 200 pi per putje van 1% ACN en 0,1% TFA in H2O Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 1 minuut. Herhaal deze stap nog twee keer. Elueer de monsters met 170 ui per putje van 50% ACN 0,1% TFA in H2O Centrifugeer bij 1500 xg gedurende 1 minuut. Herhaal de vorige stapen combineren van de verzamelde eluaat. Droog het eluaat met een stofzuiger concentrator gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Als het niet onmiddellijk wordt gebruikt, houdt de gedroogde monsters bij -80 ° C tot gebruik. OPMERKING: gedeglycosyleerde monsters voor eiwitidentificatie alleen zijn klaar voor LC-MS / MS na deze stap. Stappen 6 en 7 zijn niet vereist voor deze monsters. Ontdooi en resuspendeer de gedeglycosyleerde monsters in 2% ACN en 0,05% TFA in H2O tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van 0,5 ug / ul. Ga verder met stap 6 voor de directe glycopeptide analyse van niet-gedeglycosyleerd monsters. Eventueel filter de peptiden voorafgaand aan het merken met tandem massa-aanhangsels (TMT); Zie de aanvullende filtering moet voor peptidesynthese. 6. Etikettering van TMT (voor Direct Glycopeptide Analysis Only) Ontdooien en resuspendeer de pellets gedroogd in 50 gl 50 mM TEAB tot een concentratie van 1 ug / ul te verkrijgen. RESUSped de 0,8-mg flacon TMT nul (0 TMT, zie de Tabel Materials) reagens in 41 pi ACN. Volg recommendantions van de fabrikant voor resuspensie. Label de peptide monsters in een verhouding van 50 ug peptiden tot 0,4 mg TMT 0 (dat wil zeggen 50 ul van peptiden 20,5 pl TMT 0). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Schrik de labeling reactie door toevoeging van 5% hydroxylamine in een verhouding 6: 100 (dwz, 4,23 pl 5% hydroxylamine). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Droog de 0 TMT gelabelde peptide monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder gebruikmaking van een vacuümconcentrator. Resuspendeer in 10 pl DDH 2 O. Opmerking: Door de glycan residuen, glycopeptiden vertonen een hoger molecuulgewicht dan niet-geglycosyleerde peptiden. TMT 0 verhoogt de laadtoestand van glycopeptiden. Dit vermindert hun relatieve massa (m / z) lading ratio's en vergemakkelijkt ETD fragmentatie. 7. glycopeptide Enrichment Met omzetting buffers die in de kit (zie de Tabel Materials). Voeg 50 ul bindingsbuffer aan elke 10 pi monster uit stap 6.5. Vortex glycocapture de harsoplossing tot het homogeen wordt. Gebruik een zwitterionische hydrofiele interactie vloeistofchromatografie (ZIC-HILIC) gebaseerde vangen 15. Aliquot 50 pi van de harssuspensie nieuwe 1,5 ml buizen. Spin gedurende 1 min bij 2500 x g en de bovenstaande vloeistof. Voeg 60 ul monster (dat wil zeggen, het monster met bindingsbuffer) aan de buizen met hars pellets. Meng met een pipet en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten in beweging bij 1200 rpm. Centrifugeer gedurende 2 min bij 2.000 xg en het supernatant over te dragen naar nieuwe buizen. Houd de buizen. Voeg 150 ul wasbuffer de harsbuizen. Meng met een pipet en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in beweging bij 1200 rpm. Centrifugeren gedurende 2 min bij 2.500 x g. Overdrachtde supernatant dezelfde buizen (uit stap 7.4). Herhaal het wassen stappen twee keer. Voeg 75 pl elutiebuffer toe en meng met een pipet. Beweeg bij 1200 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij 2500 x g. Breng de supernatanten nieuwe 1,5 ml buizen. Herhaal het wassen stappen en breng het eluaat supernatant aan dezelfde buis. Centrifugeer de buisjes met het eluaat (dwz glycopeptiden) gedurende 2 min bij 2.500 x g. Breng de supernatant over naar nieuwe buisjes om de verwijdering van resterende hars uit de vorige stappen garanderen. Droog het totaal 150 pi eluaat met een stofzuiger concentrator gedurende ongeveer 2 uur bij kamertemperatuur. Resuspendeer de gedroogde beneden glycopeptiden in 15 pl 2% ACN en 0,05% TFA in DDH 2 O. Gaat uitvoeren LC-MS / MS fragmentatie met behulp HCD de ECM eiwitsamenstelling analyseren en LC-MS / MS met behulp HCD en ETD versplintering voor glycopeptide karakteriseren. Zie rubriek 8. </ol> 8. massaspectrometrie Analyse Uitvoeren van LC-MS / MS fragmentatie met behulp HCD de ECM proteïnesamenstelling te analyseren; zie de aanvullende Methoden voor details. Uitvoeren van LC-MS / MS met behulp HCD en ETD versplintering voor glycopeptide karakteriseren (zie Aanvullende werkwijzen voor details); het verrijkte monster moet worden vergeleken met de niet-verrijkte uitgangsmateriaal 15. OPMERKING: Gedetailleerde beschrijvingen van LC-MS / MS methoden voor indirecte glycopeptide analyse, directe glycopeptide analyse en databankonderzoek zijn in de Supplemental Methods. Onderzoekers geïnteresseerd in het karakteriseren van ECM eiwitten en glycaansamenstelling met massaspectrometrie worden aangemoedigd om te verwijzen naar eerdere publicaties 3, 11, 15.

Representative Results

Een schematische werkstroom van het protocol gegeven in figuur 1. ECM extractieprotocol De efficiëntie van de extractie kan worden gecontroleerd door het uitvoeren aliquots vormen elk extract Bis-Tris acrylamide gels en met behulp van zilverkleuring van visualisatie. Figuur 2A toont de complementariteit van de NaCl, SDS en GuHCI extracten na sequentiële extractie. Deze QC maakt identificatie van potentiële problemen met monsterkwaliteit zoals overmatige afbraak eiwit. Na extractie ECM glycoproteïnen overvloedig in de GuHCl extracten (Figuur 2B). deglycosylering Om de efficiëntie van deglycosylatie te beoordelen, dient een niet-gedeglycosyleerd controle worden uitgevoerd in parallel. Deglycosylering tijden geschikt is om een volledige en homogene verwijdering van suikerresten bereiken, zoals geïllustreerd in figuur 3A. Figuur 3B toont een representatief voorbeeld van monsters efficiënt gedeglycosyleerd door toevoeging van enzymen voor GAG verwijdering en deglycosylatie enzymen die kleiner N- en O-gekoppelde oligosacchariden richten. glycoproteoomanalyses Het protocol voor de beoordeling van de bezetting van NXT / S sequons verbetert eiwitsequentie dekking voor ECM glycoproteïnen na MS (figuur 3C) en zorgt voor een eerste screening van de aanwezigheid van glycoproteïnen. Dit helpt om de zoektijd voor glycopeptiden te beperken, zoals databases kunnen worden aangepast aan de eerder geïdentificeerde glycoproteïnen bevatten. HCD-ETD fragmentatie wordt gebruikt voor de identificatie en karakterisatie samenstelling van oligosachariden gehecht aan ECM g lycoproteins. Figuur 4A toont een representatief spectrum verkregen voor een peptide gemerkt met 18O na deglycosylering (indirecte glycopeptide analyse). Figuur 4B is een representatief voorbeeld van een spectrum verkregen na analyse van intacte glycopeptiden van ECM extracten (directe glycopeptide analyse). Figuur 1: Overzicht Method. (A) Na sequentiële verrijking voor ECM proteïnen, LC-MS / MS analyses uitgevoerd op de gedeglycosyleerde extracten. (B) Als alternatief kunnen niet gedeglycosyleerde ECM extracten zijn verrijkt voor glycopeptiden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 2" src = "/ files / ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg" /> Figuur 2: Extractie van ECM eiwitten. (A) De 3 verschillende fragmenten van de sequentiële extractieprocedure ( "Engels Quickstep") complementair in hun eiwitgehalte. Terwijl SDS-extracten verrijkt in intracellulaire eiwitten, GuHCl extracten bevatten de meeste ECM eiwitten. Succesvolle fractionering wordt gevisualiseerd door de verschillende kleuren met zilver patroon. (B) ECM proteïnen zoals de kleine leucine-rijke proteoglycanen decorine, biglycan en mimecan worden voornamelijk aangetroffen in de extracten GuHCl, met weinig aanwezigheid in het SDS en NaCl extracten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3. Analyse van Glycosylation. (A) geschikte incubatietijden vereist voor volledige deglycosylatie. Het voorbeeld toont het effect van de incubatietijd gedurende het verwijderen van glycosaminoglycan ketens van het glycoproteïne decorine. (B) ECM glycoproteïnen zijn ingericht met grote en herhaalde glycosaminoglycan ketens en korte en diverse N- en O-gebonden oligosachariden. Laan 1 op elk van de immunoblots vertegenwoordigt onbehandelde cardiale extracten. Laan 2 bevat extracten behandeld met enzymen die glycosaminoglycanen verteren. De monsters in laan 3 bevat bovendien enzymen voor het verwijderen van de N- en O-gekoppelde oligossacharides. Galectine-1 niet geglycosyleerd, derhalve is er geen verschuiving eiwitgrootte. Aangepast van Lynch M, et al. 4 (C) In LC-MS / MS analyse werden monsters behandeld met PNGase-F in aanwezigheid van H2 18 O bereiken betere dekking sequentie (%, rechts) in vergelijking met niet-gedeglycosyleerde monsters. Dark groene vakken geven sequentie dekking met LC-MS / MS. De rode, stippellijnen glycosites met getallen die de aminozuurpositie. Detectie van glycosylering van decorine op positie 211 Asn (N, vetgedrukt) is in detail getoond als voorbeeld in figuur 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur zien. Glycopeptide figuur 4. Analyse van MS. (A) Een shotgun proteomics benadering ECM verrijkte extracten kunnen glycopeptiden worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van gedeamideerde asparagine binnen NXT / S sequons en gemerkt met 18 O. Het voorbeeld toont een HCD MS / MS spectrum voor een peptide met de decorine eerder geglycosyleerd Asn 211. De verkregen gegevens kunnen worden gebruiktom een ​​aangepaste database van ECM glycoproteïnen te creëren. (B) HCD-ETD fragmentatie wordt gebruikt om het glycopeptide ECM verrijkte extract te analyseren. De EBR MS / MS-spectrum maakt de karakterisering van glycaansamenstelling. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. A. Stock oplossingen DTT (Dithiotreitol, C4-H 10 O 2S 2) 100 mM DTT in DDH 2 O. 1 EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur, C 10H 16N 2O 8) 250 mM EDTA in DDH 2 O, pH 8,0. GuHCl (guanidine hydrochloride, CH 6 ClN 3) 8 M GuHCl inDDH 2 O. IAA (Joodacetamide, C2 H4 INO) 500 mM IAA in DDH 2 O. 1,2 Na-acetaat (natriumacetaat, C2 CH3 NaO 2) 1 M Na-acetaat in DDH 2 O, pH 5,8. NaCl (natriumchloride, NaCl) 1 M NaCl in DDH 2 O. Natriumfosfaat dibasisch (dinatriumfosfaat, Na2 H2 PO4) 1 M natriumfosfaat dibasisch dd H2O, pH 6,8. SDS (natrium dodecyl sulfaat, NaCl 12 H 25 SO 4) 1% SDS (35 mM) in DDH 2 O. 3 TFA (trifluorazijnzuur, C2 HF 3 O 2) 10% TFA (1,2 M) in DDH 2 O. TEAB (triethylammoniumbicarbonaatbuffer, C7 H17 </sub> NO3) 1 M TEAB in in ddH2O, pH 8,5 Thioureum (Thioureum, CH 4N 2S) 3 M thioureum in DDH 2 O. Tris-HCl (tris-hydrochloride (NH 11C 4O 3 [HCl]) 100 mM Tris-HCl in DDH 2 O, pH 7,5. Ureum (ureum, CH4 N2O) 9 M ureum in DDH 2 O. B. Reactie buffers C18 sanering equilibratiebuffer 1% ACN 0,1% TFA in DDH 2 O C18 clean-up kolom wasbuffer 80% ACN 0,1% TFA in H2O C18 sanering elutiebuffer 50% acetonitril, 0,1% TFA in DDH 2 O Deglycosylatie Buffer (4x) 600 mM NaCl en 200 mM Na-fosfaat in DDH 2 O, pH 6,8. GuHCI buffer 4 4 M guanidinehydrochloride, 50 mM Na-acetaat en 25 mM EDTA in DDH 2 O, pH 5,8. Voeg 1: 100 (v: v) van de cocktail van proteaseremmers voor gebruik. NaCl buffer 4 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl en 25 mM EDTA in DDH 2 O, pH 7,5. Voeg 1: 100 (v: v) van de cocktail van proteaseremmers voor gebruik. PBS (1x) 1,7 mM KH 2PO 4, 5 mM Na2 HPO 4, 150 mM NaCl, pH 7,4. Voeg 25 mM EDTA en 1: 100 (v: v) cocktail van proteaseremmers voor gebruik. Monsterbuffer (4x) 100 mM Tris, 2% SDS, 40% glycerol, 0,02% broomfenolblauw in DDH 2 O, pH 6,8. Voeg 10% ß-mercaptoethanol voor gebruik. SDS buffer 4 0,1% SDS en 25 mM EDTA in DDH 2 O. Voeg 1: 100 (v: v) cocktail van proteaseremmers beferts gebruik. C. Enzymes Chondroïtinase ABC 5 0,5 U / ml in deglycosylatie buffer (1x) Keratanase 5 0,1 U / ml in deglycosylatie buffer (1x) Heparinase II 5 0,1 U / ml in deglycosylatie buffer (1x) α2-3,6,8,9-neuraminidase (sialidase) 5 0,025 U / ml in deglycosylatie buffer (1x) β1,4-galactosidase 5 0,015 U / ml in deglycosylatie buffer (1x) P-N-acetylglucosaminidase 5 0.25 U / ml in deglycosylatie buffer (1x) Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) 5 0,013 U / ml in deglycosylatie buffer (1x) PNGase-F (N-glycosidase-F) 6 50 U / ml in H2 18 O trypsine 0,01 ug / ul in TEAB-buffer Tabel OPMERKINGEN. 1 Houd voorraad oplossing bevroren bij -20 ° C. 2 IAA moeten beschermd tegen het licht worden gehouden. 3 SDS gemakkelijk kristalliseert bij <20 ° C. Om solubilisatie van 1% SDS (voorraadoplossing) te vergemakkelijken, verwarm de buffer onder warm kraanwater. 4 Extractie buffers kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur. Voeg breed-spectrum cocktail van protease-remmers als voor gebruik aangegeven. 5 Deze enzymen worden tijdens de eerste stap deglycosylatie worden toegevoegd. 6 PNGase-F moet alleen worden toegevoegd gedurende de tweede stap deglycosylatie. </td> Tabel 1: De Solutions, Reaction Buffers en enzymen. Deze tabel geeft de samenstelling van elke voorraadoplossing en reactiebuffer die voor de winning en verdere verwerking (met inbegrip van enzymatische digesties) van cardiale ECM eiwitten voorafgaand aan MS analyse.

Discussion

Deze proteomics protocol is geoptimaliseerd in de afgelopen jaren in ons laboratorium. Hier gebruikten we hartweefsel, maar slechts kleine aanpassingen kan nodig zijn voor de toepassing ervan op andere weefsels. Bijvoorbeeld de extractie protocol moet de cellulariteit van het weefsel rekening houden. Hartweefsel is zeer cellulaire opzichte van vaatweefsel. Bij gebruik van vaatweefsel, kan de SDS-concentratie lager (dwz 0,08%) en de cellen ontdoen korter (dus 4 h) 11, 12, 13. Het gebruik van deglycosylatie enzymen is cruciaal voor LC-MS / MS analyse van ECM samenstelling. Echter, incubatietijden worden aangepast voor verschillende soorten weefsel. Bijvoorbeeld, heparinase II bepaalde verlengde incubatietijden bij 25 ° C bij gebruik van monsters zoals huid, die rijk basaalmembraaneiwitten (bv agrine, perlecan) (data niet getoond). Direct glycopeptide analyse kan worden uitgevoerd op geconditioneerde media van cellen in kweek 15. Verrijkingsstappen is niet vereist voor de analyse van deze vereenvoudigde subproteome. Soortgelijke GuHCl extracten, extracten NaCl ook geschikt voor glycoproteoomanalyses analyse met kleine modificaties. Andere extractie protocollen voor verrijking van ECM eiwitten kunnen worden aangepast aan ECM glycopeptiden 19, 20 te karakteriseren.

Glycosylering is de meest complexe PTM 5. Indirecte identificatie van glycopeptiden wordt bereikt door de detectie van gedeamideerde Asn met geïntegreerde 18 O een NXT / S sequon. Gedeamideerd Asn op andere posities kan valse positieven geven. Evenzo moet N-glycosylering worden gezien in de context van eiwit ontologieën: intracellulaire eiwitten die een NXT / S sequon niet geglycosyleerd, maar kunnen leiden tot valse positieven. Aangezien de huidige zoekoplossingh algoritmen niet mogelijk voor het screenen van PTMs op vooraf vastgestelde sequenties (dwz Asn bij NXT / S) wordt handmatig filteren van de data vereist. Identificatie van de aanwezigheid / afwezigheid van glycosylering op deze posities kan worden vergeleken tussen ziekten en controlemonsters. Er is geen enzym overeen met PNGase F O-deglycosylatie (dwz een mass shift op threonine of serine). Daarom is de identificatie van O-glycosylatie beperkt tot directe glycopeptide analyse. Direct glycopeptide analyse wordt gebruikt om gegevens over de samenstelling van suikers aan eiwitten verbonden te verkrijgen, maar heeft geen structurele informatie van de glycan te verschaffen. Bovendien is de glycaansamenstelling het resultaat van glycan synthese en verwerking na uitscheiding.

Ons 3 stappen extractiemethode voor ECM proteïnen ( "Engels Quickstep") 6 is toegelaten karakteriseren van de ECM in diverse cardiovasculaire weefsels. Fractionering van het weefselin verschillende fragmenten is nodig om een vereenvoudigde ECM proteoom verkrijgen elders 6 besproken. Intracellulaire eiwitten anders bijdraagt ​​aan een overmatige dynamische bereik van eiwit abundantie in de extracten die geïdentificeerd minder overvloedig ECM eiwitten belemmeren. Bovendien intracellulaire eiwitten dragen O-glycosyleringen 5 die ECM glycopeptiden verrijking en daaropvolgende MS analyse zou bemoeilijken. Andere auteurs toegepaste vergelijkbaar extractie methodologieën te karakteriseren bijvoorbeeld long- 21 en kraakbeenweefsels 10, maar hebben ze niet de analyse van glycosylering streven. Eerdere analyse van glycosylatie gericht op de identificatie van slechts glycosites, vereist verwijdering van het glycan van de eiwitkern, en kan O-glycosylering 22, 23 niet beoordelen. Lectine arrays en chemische verrijking zijn voor de beoordeling van glycan types op biologische monsters op basis van hun bindingsspecificiteit, maar deze technieken kunnen niet glycan types toe te wijzen aan specifieke eiwitten 24 noch kunnen zij beoordelen glycosyleringsplaatsen.

Aanvankelijk gebruikten we gelelektroforese vóór LC-MS / MS van ECM eiwitten. Hoewel gelscheiding bruikbaar bij het verkrijgen vereenvoudigde eiwitfracties ontvankelijk voor LC-MS / MS analyse uiterlijk instrumenten zodat een hogere scansnelheden. Zo kan de elektroforetische scheidingsstap wordt weggelaten. Dit verschaft een extra voordeel zo groot ECM proteïnen, die worden vastgehouden op de top van de gel, efficiënter geanalyseerd. Echter, informatie over de Mw van de intacte eiwitten verloren. Het verdampen voorafgaand aan PNGase F deglycosylering waarborgt volledige verwijdering van vaste H2O valse negatieven te minimaliseren. Suikerresten (dwz variabele glycan gewichten) interfereren met de scheiding door LC en beschadigen daaropvolgende peptidenidentificatie door MS / MS. Apeen deglycosylatie-protocol wordt ook aanbevolen voor proteomics analyse van ECM eiwitten niet gericht op glycosylering.

Proteomics kan ongekende inzichten in de ECM te bieden. Beyond structurele steun, glycanen aan de ECM essentieel voor gastheer-pathogeen interactie, cel-cel communicatie en de immuunrespons 25, dat wil zeggen transplantaatafstoting na orgaantransplantatie. Glycoproteoomanalyses zal een essentieel instrument in glycobiology zijn.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JBB is een Career Establishment Fellow in het King's British Heart Foundation Centre. MM is een Senior Fellow van de British Heart Foundation (FS / 13/2/29892). De studie werd ondersteund door een uitmuntende initiatief (Competence Centers for Excellent Technologies – COMET) van de Oostenrijkse Research Promotion Agency FFG: "Research Center of Excellence in Vascular Aging – Tirol, VASCage" (K-Project nummer 843.536) en de NIHR Biomedical Research Center gevestigd in de National Health service Foundation Trust Guy's en St. Thomas' en King's College in Londen in samenwerking met King's College Hospital.

Materials

A. Chemicals
Acetonitrile, MS-grade (ACN, C2H3N) Thermo Scientific 51101 5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4
Cocktail of proteinase inhibitors Sigma-Aldrich P8340 1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Disodium phosphate (Na2H2PO4) Sigma-Aldrich S7907 3.1
Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2) Sigma-Aldrich D0632 4.3
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8) Sigma-Aldrich E9884 1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Ethanol (C2H6O) VWR 437433T 2.2.1
Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3) Sigma-Aldrich G3272 1.6.1
Glycerol (C3H8O3) Acros organics 158920025 Suppl 1.1
H2O LC-MS Cromasolv Sigma-Aldrich 39253-1L-R Throughout the protocol
H218O Taiyo Nippon Sanso FO3-0027 3.5
Hydroxylamine (HA, H3NO) Sigma-Aldrich 467804 6.4
Iodoacetamide (IAA, C2H4INO) Sigma-Aldrich A3221 4.4
Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X Lonza 51226 1.3
Sodium acetate (C2H3NaO2) Sigma-Aldrich S7545 1.6.1
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 1.4.1, 3.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4) Sigma-Aldrich 466143 1.5.1
Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3) Sigma-Aldrich 11268 4.7, 6.1
Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) Sigma-Aldrich T62200 4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3
Thiourea (CH4N2S) Sigma-Aldrich T8656 4.2
Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl]) Sigma-Aldrich T3253 1.4.1, Suppl 1.
Urea (CH4N2O) Sigma-Aldrich U1250 4.2
Name Company Catalog Number Comments
B. Enzymes
α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase) EDM Millipore 362280 (KP0012) 3.1
β1,4-Galactosidase EDM Millipore 362280 (KP0004) 3.1
β-N-Acetylglucosaminidase EDM Millipore 362280 (KP0013) 3.1
Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C3667 3.1
Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) EDM Millipore 362280 (KP0011) 3.1
Heparinase II Sigma-Aldrich H6512 3.1
Keratanase Sigma-Aldrich G6920 3.1
PNGase-F (N-Glycosidase F) EDM Millipore 362280 (KP0001) 3.5
Trypsin Thermo Scientific 90057 4.7
Name Company Catalog Number Comments
C. Reagent kits
30 kDa MWCO spin filters  Amicon, Millipore 10256744 5.9, Suppl 2
Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate Harvard Apparatus 74-5657 5.1
NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels Thermo-Scientific NP0322PK2 Suppl 1
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 2.1.3
ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit Merk Millipore 72103 7
Tandem mass tag 0 (TMT0) Thermo Scientific 900067 6.2, 6.3
Name Company Catalog Number Comments
D. Equipment and software
Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300µm, 5µm, 100Å Thermo Scientific 160454 Suppl 3, 4
Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75µm, 3µm, 100Å Thermo Scientific 164570 Suppl 3
Byonic Search Engine Protein Metrics Version 2.9.30 Suppl 5
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano Thermo Scientific n/a Suppl 3, 4
EASY-Spray Ion Source  Thermo Scientific ES081 Suppl 4
EASY-Spray PepMap RSLC C18,  50cm x 75µm, 2μm, 100Å Thermo Scientific ES803 Suppl 4
Mascot Search Engine Matrix Science Version 2.3.01 Suppl 3
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBHQ Suppl 4
Proteome Discoverer Software Thermo Scientific Version 2.1.1.21 Suppl 3, 5
Picoview Nanospray Source New Objective 550 Suppl 3
Q Exactive HF Mass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFALGMBFZ Suppl 3
Savant SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA 2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11
Scaffold Software Proteome Software  Version 4.3.2 Suppl 3
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, K. E., Turner, N. A. Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling. Pharmacol. Ther. 123 (2), 255-278 (2009).
  2. Barallobre-Barreiro, J., et al. Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury. Circulation. 125 (6), 789-802 (2012).
  3. Barallobre-Barreiro, J., et al. Glycoproteomics reveals decorin peptides with anti-myostatin activity in human atrial fibrillation. Circulation. 134 (11), 817-832 (2016).
  4. Lynch, M., Barallobre-Barreiro, J., Jahangiri, M., Mayr, M. Vascular proteomics in metabolic and cardiovascular diseases. J. Intern. Med. 280 (4), 325-338 (2016).
  5. Varki, A., Lowe, J. B., Varki, A. Biological Roles of Glycans. Essentials of glycobiology. 2nd ed. , (2009).
  6. Barallobre-Barreiro, J., Lynch, M., Yin, X., Mayr, M. Systems biology – opportunities and challenges: The application of proteomics to study the cardiovascular extracellular matrix. Cardiovasc. Res. , (2016).
  7. Agnetti, G., Husberg, C., Van Eyk, J. E. Divide and conquer: the application of organelle proteomics to heart failure. Circ. Res. 108 (4), 512-526 (2011).
  8. Mason, R. M., Mayes, R. W. Extraction of cartilage protein-polysaccharides with inorganic salt solutions. Biochem. J. 131 (13), 535-540 (1973).
  9. Vogel, K. G., Peters, J. A. Isolation of proteoglycans from tendon. Methods. Mol. Biol. 171, 9-17 (2001).
  10. Wilson, R., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
  11. Barallobre-Barreiro, J., et al. Extracellular matrix remodeling in response to venous hypertension: proteomics of human varicose veins. Cardiovasc. Res. 110 (3), 419-430 (2016).
  12. Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell. Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
  13. Didangelos, A., et al. Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).
  14. Grandoch, M., et al. Loss of biglycan enhances thrombin generation in apolipoprotein E-deficient mice: Implications for inflammation and atherosclerosis. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 36 (5), e41-e50 (2016).
  15. Yin, X., Bern, M., Xing, Q., Ho, J., Viner, R., Mayr, M. Glycoproteomic analysis of the secretome of human endothelial cells. Mol. Cell. Proteomics. 12 (4), 956-978 (2013).
  16. Parker, B. L., et al. Quantitative N-linked glycoproteomics of myocardial ischemia and reperfusion injury reveals early remodeling in the extracellular environment. Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).
  17. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  18. Pepinsky, R. B. Selective precipitation of proteins from guanidine hydrochloride-containing solutions with ethanol. Anal. Biochem. 195 (1), 177-181 (1991).
  19. de Castro-Brás, L. E., et al. Texas 3-step decellularization protocol: looking at the cardiac extracellular matrix. J. Proteomics. 86, 43-52 (2013).
  20. Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. Enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis. J Vis Exp. (101), e53057 (2015).
  21. Decaris, M. L., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell. Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
  22. Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat. Biotechnol. 21 (6), 660-666 (2003).
  23. Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J. Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
  24. Li, Y., et al. Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated prostate-specific antigen revealing differential distribution of glycosylated prostate-specific antigen isoforms in prostate cancer tissues. Anal. Chem. 83 (1), 240-245 (2011).
  25. Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial extracellular matrix: an ever-changing and diverse entity. Circ. Res. 114 (5), 872-888 (2014).

Tags

GlycoproteomicsExtracellular MatrixGlycosylationMass SpectrometryCardiovascular DiseaseGlycopeptide AnalysisGlycosylation Site Occupancy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Barallobre-Barreiro, J., Baig, F., Fava, M., Yin, X., Mayr, M. Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (122), e55674, doi:10.3791/55674 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image