細胞外マトリックスのグライコ：質量分析法を用いて無傷の糖ペプチドの分析のための方法

研究では、ウォンズワース地域研究倫理委員会によって承認された（参照番号：06 / Q0803 / 37）して、研究開発事務所から制度の承認を受けました。すべての患者は書面によるインフォームドコンセントを与えました。 細胞外マトリックスタンパク質の1の抽出注：これらの実験に使用したヒトの心房組織は、単に心の心臓麻痺逮捕後、心肺バイパス中に心耳から得ました。すべてのサンプルは、セント・ジョージ病院、ロンドン、英国で収集しました。すべての組織サンプルは、-80℃で凍結されなければなりません。架橋タンパク質ことを、パラホルムアルデヒドのような固定剤、保存したサンプルを使用しないでください。 抽出工程間の時間を最小限に抑えるために、 表1の通り、実験の前に全ての抽出バッファーを準備します。温度制御された環境で、室温（RT）で、すべてのインキュベーションを行います（ すなわち、〜20℃）で抽出間の整合性を確保します。 組織の20〜50 mgの計量。いくつかのサンプルを抽出する場合は、一つ一つが、組織の完全な融解を避けるためにそれらをカットし、重量を量ります。メスを用いて、3-4小さな断片（ すなわち2-3 mm）の中に組織をダイシングし、1.5mLのチューブにそれらを一緒に置きます。 （PBS; 表1および材料の表を参照） を氷冷リン酸緩衝生理食塩水500μLを加え、血液汚染を最小限にするために5回の洗浄を行います。 抽出ステップ1：NaClの緩衝液とのインキュベーション PBSで洗浄した後、スクリューキャップ付き1.5mLのチューブにサンプルを置きます。 NaCl緩衝液を追加 組織重量：10回（W V）である（ 表1を参照されたいです）。ボルテックス最小速度（ すなわち、600 rpm）で1時間室温でチューブ。 注：低渦速度は、このステップの間に組織の機械的破壊を避けるために重要です。抽出時にすべてのチューブを配置するフォームアダプターを使用してください。 4℃で10分間16,000×gで新しいチューブと遠心分離機の抽出物を移します。使用するまで-20℃で抽出物を保管してください。簡単に述べると、新鮮な食塩緩衝液で残りの組織ペレットを洗浄します。バッファの同じタイプを使用する（ すなわち、NaCl緩衝液100μL）洗浄のためには、異なる溶解度（NaClで抽出しない、すなわち、タンパク質）を有する他のタンパク質の抽出を防止します。 洗浄した後、その後の抽出工程を有するタンパク質含有量のオーバーラップを最小化するためのバッファの完全な除去を保証します。洗浄に使用されるNaCl緩衝液を捨てます。 注：バッファボリュームと組織重量の比が再現可能な抽出のために重要です。 10：1の比（V：w）のNaClおよびSDS抽出および5：1のGuHClステップのためのバッファを飽和させることなく、タンパク質の十分な量を提供します。タンパク質濃度がext後、約1〜2μgの/μLですraction。 抽出ステップ2：SDSバッファーで脱細胞化 10倍（V：W）でのSDS緩衝液（ 表1）を追加組織重量。低いSDS濃度（ すなわち、0.1％）を使用することは、脱細胞化中にECMタンパク質の損失を避けるために重要です。ボルテックス最小速度（ すなわち、600 rpm）で16時間室温でチューブ。 注：低渦速度はECMの機械的破壊を最小限に抑えることができます。 新しいチューブに抽出を転送します。 4℃で10分間16,000×gで遠心。使用するまで-20℃で保存します。簡潔に述べると、SDSを除去するためにDD H 2 Oと残りの組織ペレットを洗浄します。洗浄後の液体の完全な除去を確認してください。 抽出ステップ3：のGuHClバッファーとのインキュベーション 組織重量：5回（W V）でのGuHCl緩衝液（ 表1）を加えます。渦最高速度で72時間、室温で管（ すなわち、 </em>の3,200 rpm）で。激しいボルテックスは、ECMの機械的破壊を促進します。 新しいチューブに抽出を転送します。 10 4°Cで分、使用するまで-20℃で保存のために16,000×gで遠心。 2.タンパク質定量と降水量注：界面活性剤の存在に起因し、SDSバッファーが280 nmの吸光度の測定値に基づいて、直接タンパク質定量と互換性がありません。再現性の定量化を確実にするために、すべてのタンパク質抽出物17のための比色アッセイを使用しています。 定量。 直列適切な抽出緩衝液（ すなわち、NaClを、SDS、またはのGuHCl）17で希釈したウシ血清アルブミン（BSA）を用いて検量線用標準液を調製。この間に、サンプル抽出物を解凍します。 内濃度を得るために、抽出緩衝液中の試料を希釈吸光度の直線範囲。 1:10希釈（V：V）は、満足のいく結果が得られます。比色アッセイは、> 4 MのGuHCl濃度と互換性がないように、定量のためのddH 2 Oの等量のGuHClサンプルを希釈します。 ビシンコニン酸（BCA）を使用して96ウェルプレート中のアッセイのために、製造業者の説明書に従って、比色アッセイ17（ 材料の表を参照）ベース。少なくとも重複測定を実行することをお勧めします。 30分間インキュベートした後、BSA標準較正曲線17を用いてタンパク質濃度を計算するために、570ナノメートルの波長での吸光度の読みを取ります。 タンパク質沈殿 雪解けのGuHClをRTで抽出します。アリコートを新しいチューブに各サンプルについて10μgのタンパク質。直接糖ペプチドの分析のために、一定分量の50μg。エタノールとincuの10倍のボリュームを追加BATE一晩-20℃。 注：のGuHClは、さらに酵素反応とほとんどの電気泳動のアプリケーションとの互換性はありません。 GuHClの除去は、脱グリコシル化およびトリプシン消化の前に必要とされます。タンパク質18の約98％の回収率を得ながら、エタノール中のGuHClの溶解度と、逆に、タンパク質の低溶解度は、のGuHClの効果的な除去を可能にします。 4℃で30分間16,000×gでサンプルを遠心分離し、上清を吸引します。沈殿したペレットを乱さないように注意してください。 RTで真空濃縮し（ 材料の表を参照）を用いて15分間、ペレットを乾燥させます。 注：プロトコルはここで停止することができ、乾燥したペレットを使用するまで-20℃で保存しました。 必要に応じて、品質管理として、ゲル電気泳動を実行する（QC、 補足の方法を参照のこと）。 3.シーケンシャル脱グリコシル化N-グリコシル化部位占有の評価試料乾燥（ステップ2.2.2を参照）の間に、 表1のとおり、枝切り脱グリコシル化酵素を含有する脱グリコシル化緩衝液を調製します。製品の詳細については、 資料の表を参照してください。 各サンプルに酵素を含む脱グリコシル化緩衝液10μLを追加します。サンプルの迅速な渦とスピンダウンを実行することにより、適切なペレットの再懸濁を確認してください。 注：脱分枝酵素を用いて糖モノマーの除去は、O結合型複合糖質の後続と完全に除去するために必須であり、PNGアーゼFによってN結合型糖の後の切断を容易にします。 37°Cまで温度II.Increaseヘパリナーゼによるヘパラン硫酸の除去を可能にし、穏やかに撹拌しながら36時間インキュベートし、25℃で2時間インキュベートします。 注：、低反応体積および長期のインキュベーション時間を考えるとインキュベーターシェーカーを使用し、しっかりと、複数の1.5mLの浴槽を詰めます約45℃のインキュベータの内側に傾いて50mLのコニカルチューブ内部ES。 36時間後、16,000×gで1分間サンプルを遠心分離 そして蒸発 約45分間、RTで真空濃縮器を用いて試料からH 2 O。 50 U / mLのPNGアーゼFを含有するH 2 18 Oの10μLで乾燥試料を再懸濁し、切断する脱アミド化反応における全てのアスパラギン結合グリカン。 注：得られたアスパラギン酸は、MS分析中のN-グリコシル化の存在を示す2.98ダの過剰量を、運びます。 インキュベーターシェーカーで一定の攪拌下、37℃で36時間インキュベートします。 4.溶液内トリプシン消化注：この手順は、非脱グリコシル化の両方のために行う（ すなわち、直接糖ペプチドの分析に使用）および脱グリコシル化されたサンプルされなければならない（ すなわち、グリカンOCの評価のために使用cupancy）。 （前の手順で示されるように）N-グリコシル化部位占有の評価のための総タンパク質10μgのを使用。直接グリコペプチド解析のために意図されたサンプルについて、開始量として50μgのタンパク質を使用します。 注：次の手順は、10μgのタンパク質のために記載されています。必要に応じて第evolumes（ すなわち、5回50μgのための）スケールアップ。 それぞれ6 M尿素および2 Mチオ尿素の最終濃度で、9 M尿素および3 Mチオ尿素を使用して、各サンプルのアリコートにタンパク質を変性（10μLの試料について、例えば 、尿素/チオ尿素の20μL）。 100mMのジチオトレイトール（：10mMのDTT、3.33μL、最終濃度）を添加することによってタンパク質を減少させます。 240rpmで攪拌しながら1時間37℃でインキュベートします。 0.5 Mヨードアセトアミド（50mMの3.7μL、最終濃度）を加えることによってアルキル化を行う前にRTにサンプルを冷却します。 1時間暗所でインキュベートします。 -20（予備冷却に使用°C）をアセトン（サンプルの6倍体積）を-20℃で一晩試料をインキュベートします。 4℃で25分間14,000×gでの遠心分離によって沈殿します。 上清を吸引除去します。沈殿したペレットを乱さないように注意してください。 RTで30分間真空濃縮器を用いてタンパク質ペレットを乾燥させます。 0.1 M重炭酸トリエチルアンモニウム（TEAB）緩衝液、pH 8.2の20μLに再懸濁し、含有トリプシン（0.01μgの/μL）、37℃および240 rpmで一晩消化します。 10％トリフルオロ酢酸（TFA、1％TFAの最終濃度のために2μL）を用いてサンプルを酸性化することによって消化を停止します。 C18カラムを用いて5ペプチドのクリーンアップ注：消化後、ペプチド混合物から汚染物質を干渉の除去はイオン抑制を低減し、信号対雑音比及び配列カバー率を向上させることができます。このステップは、両方の非脱グリコシル化および脱グリコシル化SAの行われるべきですmples。 1分間1000×gで遠心分離ウェル当たりメタノール200μLを用いて、C18スピンプレート上に樹脂を（ 材料の表を参照） を活性化します。 1分間1000×gで遠心H 2 O中80％アセトニトリル（ACN）と、0.1％TFAのウェル当たり200μLを添加することによって洗浄します。 1分間1000×gで遠心H 2 O中1％ACN、0.1％TFAのウェル当たり200μLを添加することによって平衡化。このステップをさらに2回繰り返します。 1分間1,500×gで樹脂と遠心分離機を含むウェルにステップ4からのサンプル（全体積）を読み込みます。フロースルー二度目をリロードし、遠心分離を繰り返します。 1分間1500×gで遠心H 2 O中1％ACN、0.1％TFAのウェル当たり200μLを添加することによって洗浄します。このステップをさらに2回繰り返します。 1分間1500×gで遠心H 2 O中の50％ACN、0.1％TFAのウェル当たり170μLの試料を溶出します。前の手順を繰り返しますそして回収した溶出液を兼ね備えています。 RTで2時間、真空濃縮器を使用して溶出液を乾燥させます。それはすぐに使用されていない場合は、使用するまで-80℃で乾燥させたサンプルを保ちます。 注：タンパク質同定のために意図脱グリコシル化サンプルは、このステップの後にLC-MS / MSのために使用する準備ができています。ステップ6および7は、これらのサンプルには必要ありません。 0.5μg/μLの最終タンパク質濃度になるようにH 2 O中の2％ACN及び0.05％TFAで脱グリコシル化されたサンプルを解凍し、再懸濁します。非脱グリコシル化サンプルの直接糖ペプチド解析のためのステップ6に進みます。 必要に応じて、前タンデム質量タグ（TMT）で標識したペプチドをフィルタリングします。ペプチドfitrationのための補助メソッドを参照してください。 TMT 6.標識化（ダイレクト糖ペプチド分析用のみ） 1μg/μLの濃度を得るために、50mMのTEABの50μLで乾燥したペレットを解凍し、再懸濁します。 ResusPED TMTゼロの0.8 mgのバイアルACNの41μLで試薬（TMT 0は 、 材料の表を参照のこと）。再懸濁のために、メーカーのrecommendantionsに従ってください。 0.4mgのTMT 0〜50のμgのペプチドの割合（TMT 0の20.5μLのペプチドの、すなわち、50μL）でのペプチドサンプルを標識します。室温で1時間インキュベートします。 比6で5％のヒドロキシルアミンを添加することにより、標識反応をクエンチ：100（5％のヒドロキシルアミン、すなわち、4.23μL）。室温で15分間インキュベートします。 真空濃縮器を用いて、RTで1時間TMT 0 -標識ペプチドサンプルを乾燥させます。 ddH 2 O10μlに再懸濁注：原因グリカン残基に、糖ペプチドは、非グリコシル化ペプチドよりも高い分子量を表示します。 TMT 0は、糖ペプチドの電荷状態を増加させます。これは、（M / Z）比を充電するためにそれらの相対質量を減少させ、ETDフラグメンテーションを容易にします。 7。糖ペプチド濃縮キット（ 材料の表を参照）内に設けられた反応緩衝液を使用します。 ステップ6.5からの各10μLのサンプルへの結合緩衝液50μLを加えます。それが均一になるまでglycocapture樹脂溶液をボルテックス。 15を捕捉系両性イオン性親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ZIC-HILIC）を使用します。 新しい1.5 mLチューブに樹脂懸濁液のアリコートを50μL。 2,500×gで1分間スピンし、上清を除去します。樹脂ペレットを含むチューブに試料の60μL（ すなわち、結合緩衝液で試料）を加えます。ピペットを用いて混合し、1,200rpmで攪拌しながら20分間室温でインキュベート。 2,000×gで2分間遠心し、新しいチューブに上清を移します。チューブを保管してください。樹脂チューブを洗浄緩衝液150μLを加えます。ピペットを用いて混合し、1,200rpmで攪拌しながら10分間室温でインキュベート。 2,500×gで2分間スピン。転送（ステップ7.4からの）は、同じチューブに上清。洗浄は2回ステップを繰り返します。 溶出バッファーの75μLを加え、ピペットを用いて混ぜます。 RTで5分間1,200rpmで攪拌し、次いで2,500×gで2分間チューブを遠心します。新しい1.5 mLチューブに上清を移します。洗浄工程を繰り返した後、同じチューブに溶出液上清を移します。 遠心2,500×gで2分間の溶出液（ すなわち、糖ペプチド）を含有するチューブ。前のステップからの残りの樹脂の除去を確実にするために、新しいチューブに上清を移します。 室温で約2時間、真空濃縮器を用いて、溶出物の合計150μLを乾燥させます。 ddH 2 O中の2％ACN及び0.05％TFAの15μLで乾燥ダウン糖ペプチドを再懸濁糖ペプチドの特徴付けのためのHCDとETDフラグメンテーションを用いてECMタンパク質組成物を分析するHCDフラグメンテーションを使用し、そしてLC-MS / MS、LC-MS / MSを実行するように進みます。セクション8を参照してください。 </oL> 8.質量分析 ECMタンパク質組成物を分析するHCDフラグメンテーションを使用してLC-MS / MSを行います。詳細については、 補足メソッドを参照してください。 （詳細は補足の方法を参照）、糖ペプチドの特徴付けのためのHCDとETDフラグメンテーションを用いたLC-MS / MSを行います。濃縮された試料は非濃縮入力材15と比較されるべきです。 注：間接的な糖ペプチドの分析、直接糖ペプチドの分析、およびデータベース検索のためのLC-MS / MS法の詳細な説明は補足方法で提供されています。質量分析法を用いてECMタンパク質およびグリカン組成物を特徴づけることに興味の研究者は、以前の刊行物3、11、15を参照することが奨励されます。