Questo documento descrive un metodo per preparare campioni di tessuto cardiovascolari per analisi MS che permette di (1) l'analisi della composizione proteica ECM, (2) l'identificazione dei siti di glicosilazione, e (3) la caratterizzazione composizionale delle forme glicano. Questa metodologia può essere applicata, con piccole modifiche, allo studio della ECM in altri tessuti.
Fibrosi è una caratteristica di molte malattie cardiovascolari ed è associata con la secrezione esacerbato e la deposizione di matrice extracellulare (ECM). Utilizzando proteomica, abbiamo precedentemente identificati oltre 150 ECM e proteine ECM-associata in tessuti cardiovascolari. In particolare, molte proteine ECM sono glicosilate. Questa modificazione post-traduzionale colpisce ripiegamento proteico, la solubilità, la rilegatura e degradazione. Abbiamo sviluppato un metodo di estrazione sequenziale e arricchimento per proteine ECM che è compatibile con la successiva spettrometria di massa tandem cromatografia liquida (LC-MS / MS) Analisi dei glicopeptidi intatti. La strategia si basa su incubazioni sequenziali con NaCl, SDS per decellularization tessuti, e guanidina cloridrato per la solubilizzazione delle proteine ECM. Recenti progressi nella LC-MS / MS includono metodi di frammentazione, come combinazioni di dissociazione collisione alta energia (HCD) e trasferimento elettronico dissociazione (ETD), che consentonol'analisi composizionale diretta dei glicopeptidi di proteine ECM. Nel presente documento, si descrive un metodo per preparare l'ECM da campioni di tessuto. Il metodo consente non solo per la profilatura proteine, ma anche la valutazione e caratterizzazione di glicosilazione mediante analisi MS.
Fibrosi è una caratteristica di molte malattie. Fibroblasti proliferano e si differenziano verso fenotipi altamente sintetici, che sono associati con la secrezione esacerbato e la deposizione di matrice extracellulare (ECM) 1. deposizione di ECM eccessiva può continuare, anche dopo la lesione iniziale è diminuita, con conseguente compromissione funzionale. Utilizzando proteomica, abbiamo precedentemente identificati oltre 150 ECM e proteine ECM-associata nel tessuto cardiaco 2, 3. Essi non sono solo proteine strutturali, ma anche proteine matricellular e proteasi che contribuiscono alla rimodellamento continuo e adattamento dinamico del cuore. In particolare, molte proteine ECM sono glicosilate 4. Questa modificazione post-traduzionale (PTM) comporta l'aggiunta di residui di zucchero a determinate posizioni amminoacidiche, e colpisce folding, la solubilità, la rilegatura e degradazione 5 </sup>.
Ci sono due principali tipi di glicosilazione che si verificano nei mammiferi. (1) N-glicosilazione avviene all'azoto carbossammido di residui di asparagina (Asn) all'interno della sequenza consenso Asn-Xaa-Thr / Ser, dove Xaa è un qualsiasi amminoacido tranne la prolina. (2) In O-glicosilazione, residui zuccherini attribuiscono alla serina e treonina residui (Ser, Thr) o, in misura molto minore, a idrossiprolina e idrossilisina. Mentre O-glicosilazione può verificarsi in una varietà di gruppi di proteine, N-glicosilazione è limitato alle proteine secrete o domini extracellulari di proteine di membrana 5. Questo rende N-glicosilazione un bersaglio attraente quando si studia l'ECM.
Proteomica stabilisce un nuovo standard per l'analisi dei cambiamenti di proteine nella malattia. Finora, la maggior parte proteomica studi si sono concentrati sulle proteine intracellulari 6. Ciò è dovuto principalmente ai seguenti motivi. In primo luogo, abbondanti proteine intracellulari ostacolano Pidentizione dei componenti ECM scarse. Ciò è particolarmente importante nel tessuto cardiaco, in cui rappresentano mitocondriali e myofilament proteine per gran parte del contenuto proteico 7. In secondo luogo, le proteine ECM integrali sono fortemente reticolato e difficile da solubilizzare. Infine, la presenza di PTM abbondanti (Per esempio, glicosilazione) altera la massa molecolare, carica, e le proprietà elettroforetiche di peptidi, che interessano sia la separazione e l'identificazione mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS / MS). Negli ultimi anni, abbiamo sviluppato e migliorato estrazione sequenziale e metodo di arricchimento per proteine ECM che è compatibile con la successiva analisi di spettrometria di massa (MS). La strategia si basa su incubazioni sequenziali.
La prima fase viene eseguita con NaCl, un buffer ionico che facilita l'estrazione delle proteine ECM-associati e ECM debolmente legato, così come proteine ECM di nuova sintesi. E is detersivo, non denaturante, senza interruzioni delle membrane cellulari, e suscettibile di ulteriori test biochimici 8. Poi, decellularization si ottiene con sodio dodecilsolfato (SDS). A questo punto, una bassa concentrazione di SDS assicura destabilizzazione della membrana e il rilascio di proteine intracellulari mentre impedire interruzioni dei componenti ECM non interi più solubili. Infine, proteine ECM vengono estratti con un tampone guanidina cloridrato (GuHCl). GuHCl è efficace nell'estrarre proteine e proteoglicani fortemente reticolati da tessuti come tendini 9, cartilagine, 10 vasi 11, 12, 13 e cuore 2, 3. Abbiamo applicato questo frazionamento biochimico, in combinazione con la LC-MS / MS, per esplorare ECM rimodellamento nelle malattie cardiovascolari 2 <sup>, 3, 11, 12, 13, 14. I recenti progressi nella SM includono metodi di frammentazione innovativi, come combinazioni di dissociazione alta energia di collisione (HCD) e trasferimento di elettroni dissociazione (ETD), che consentono l'analisi diretta dei glicopeptidi intatte 3, 15.
Qui si descrive un metodo per preparare ECM per l'analisi MS che permette l'analisi di composizione proteica, l'identificazione dei siti di glicosilazione, e la caratterizzazione delle forme glicano. Rispetto alle precedenti analisi di ECM glicosilazione 16, questa metodologia consente la valutazione diretta dei cambiamenti di composizione nei profili di glicosilazione in modo specifico del sito utilizzando MS. Abbiamo applicato questa metodologia ai tessuti cardiovascolari. Tuttavia, si può alcosì essere applicato, con piccole modifiche, allo studio della ECM in altri campioni di tessuto e può fornire intuizioni senza precedenti in biologia ECM.
Questo protocollo proteomica è stato ottimizzato nel corso degli ultimi anni nel nostro laboratorio. Qui, abbiamo usato il tessuto cardiaco, ma solo piccoli aggiustamenti possono essere richieste per la sua applicazione ad altri tessuti. Ad esempio, il protocollo di estrazione deve assumere la cellularità del tessuto in considerazione. tessuto cardiaco è altamente cellulare rispetto al tessuto vascolare. Quando si utilizza tessuto vascolare, la concentrazione SDS può essere inferiore (cioè 0,08%) e il tempo decellularization è più breve (cioè 4 h) 11, 12, 13. L'uso di enzimi Deglycosylation è cruciale per l'analisi LC-MS / MS di composizione ECM. Tuttavia, i tempi di incubazione devono essere regolati per i diversi tipi di tessuto. Ad esempio, eparinasi II richiesti tempi di incubazione prolungati a 25 ° C se si usano campioni come pelle, che sono ricchi di proteine della membrana basale (es agrina, perlecan) (dati non mostrati). Analisi diretta glicopeptide può essere eseguita su mezzi condizionati da cellule in coltura 15. potrebbe non essere necessaria procedura di arricchimento per l'analisi di questo subproteome semplificato. Simile agli estratti GuHCl, estratti NaCl sono anche suscettibili di analisi glycoproteomics con piccole modifiche. Altri protocolli di estrazione per l'arricchimento di proteine ECM possono essere adattati per caratterizzare glicopeptidi ECM 19, 20.
La glicosilazione è il più complesso PTM 5. Identificazione indiretta dei glicopeptidi è raggiunto dalla rilevazione di deamidato Asn con incorporato 18 O a NxT / S sequon. Deamidated Asn in altre posizioni può rappresentare falsi positivi. Analogamente, N-glicosilazione deve essere considerato nel contesto di ontologie proteine: proteine intracellulari contenenti un / S sequon NxT non saranno glicosilate ma potrebbero dar luogo a falsi positivi. Come searc correnteh algoritmi non consentono la proiezione di PTM a sequenze predeterminate soltanto (cioè Asn a NxT / S), è richiesto il filtraggio manuale dei dati. Identificazione della presenza / assenza di glicosilazione in queste posizioni può essere confrontata tra campioni malattie e di controllo. Non v'è alcun enzima equivalente PNGase F per O-deglycosylation (cioè introducendo uno spostamento di massa su treonina o serina). Pertanto, l'identificazione di O-glicosilazione è limitata ad analisi diretta glicopeptide. Analisi diretta glicopeptide viene utilizzato per ottenere informazioni sulla composizione degli zuccheri attaccati alle proteine, ma non fornisce informazioni strutturali delle glicano. Inoltre, la composizione glicano è il risultato di sintesi glicano e lavorazione dopo la secrezione.
Il nostro metodo di estrazione 3 passaggi per proteine ECM ( "English Quickstep") 6 ha permesso che caratterizza l'ECM in una varietà di tessuti cardiovascolari. Frazionamento del tessutoin diversi estratti è necessario per ottenere un proteoma ECM semplificata come discusso altrove 6. proteine intracellulari altrimenti contribuire ad una gamma dinamica eccessiva di abbondanze proteici nei estratti che ostacolerebbe l'identificazione di proteine ECM meno abbondanti. Inoltre, le proteine intracellulari portano O-glycosylations 5 che complicherebbero ECM glicopeptide arricchimento e successiva analisi MS. Altri autori applicati simili metodologie di estrazione di caratterizzare per esempio polmone 21 e tessuti cartilaginei 10, tuttavia essi non perseguono l'analisi di glicosilazione. Precedente analisi di glicosilazione focalizzata sulla identificazione di soli glycosites, richiedono la rimozione del glicano dal nucleo proteina, e non può valutare O-glicosilazione 22, 23. array lectina e arricchimento chimico sono disponibili per la valutazione di tip glycanes su campioni biologici in base alla loro specificità di legame, ma queste tecniche non possono assegnare i tipi glycan a specifiche proteine 24 né possono valutare siti di glicosilazione.
Inizialmente, abbiamo utilizzato elettroforesi su gel prima LC-MS / MS di proteine ECM. Sebbene separazione gel è utile per ottenere frazioni proteiche semplificate suscettibili di analisi LC-MS / MS, i più recenti strumenti offrono velocità di scansione più veloce. Così, la fase di separazione elettroforetica può essere omesso. Ciò fornisce un ulteriore vantaggio come grandi proteine ECM, che vengono trattenuti sulla superficie del gel, vengono analizzate in modo più efficiente. Tuttavia, le informazioni riguardanti il Mw delle proteine intatte è perduto. La fase di evaporazione prima PNGase F deglycosylation assicura una rimozione completa di regolare H 2 O per minimizzare falsi negativi. Residui di zuccheri (cioè masse glicani variabile) interferiscono con la separazione da LC e compromettono la successiva identificazione peptide MS / MS. A pan-deglycosylation protocollo viene consigliato anche per l'analisi proteomica di proteine ECM non focalizzati su glicosilazione.
La proteomica possono fornire informazioni senza precedenti nella ECM. Oltre il sostegno strutturale, glicani attaccati alla ECM sono essenziali per l'interazione ospite-patogeno, comunicazione cellulare e la risposta immunitaria 25, cioè il rigetto di allotrapianto dopo trapianto d'organo. Glycoproteomics sarà uno strumento essenziale nella glycobiology.
The authors have nothing to disclose.
JBB è una struttura di carriera Fellow nel Re British Heart Foundation Center. MM è Senior Fellow della British Heart Foundation (FS / 13/2/29892). Lo studio è stato sostenuto da un'iniziativa di eccellenza (centri di competenza per tecnologie di eccellenza – COMET) dell'Agenzia austriaca per la promozione della ricerca FFG: "Centro di Ricerca di Eccellenza in Vascolare Aging – Tirolo, VASCage" (numero di K-Project 843.536) e il NIHR Ricerca Biomedica Centro base al National Health Service Foundation trust San Tommaso di Guy e e king college di Londra, in collaborazione con l'Ospedale college del re.
A. Chemicals | |||
Acetonitrile, MS-grade (ACN, C2H3N) | Thermo Scientific | 51101 | 5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4 |
Cocktail of proteinase inhibitors | Sigma-Aldrich | P8340 | 1.3, 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1 |
Disodium phosphate (Na2H2PO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | 3.1 |
Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2) | Sigma-Aldrich | D0632 | 4.3 |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8) | Sigma-Aldrich | E9884 | 1.3, 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1 |
Ethanol (C2H6O) | VWR | 437433T | 2.2.1 |
Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3) | Sigma-Aldrich | G3272 | 1.6.1 |
Glycerol (C3H8O3) | Acros organics | 158920025 | Suppl 1.1 |
H2O LC-MS Cromasolv | Sigma-Aldrich | 39253-1L-R | Throughout the protocol |
H218O | Taiyo Nippon Sanso | FO3-0027 | 3.5 |
Hydroxylamine (HA, H3NO) | Sigma-Aldrich | 467804 | 6.4 |
Iodoacetamide (IAA, C2H4INO) | Sigma-Aldrich | A3221 | 4.4 |
Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X | Lonza | 51226 | 1.3 |
Sodium acetate (C2H3NaO2) | Sigma-Aldrich | S7545 | 1.6.1 |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 1.4.1, 3.2 |
Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4) | Sigma-Aldrich | 466143 | 1.5.1 |
Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3) | Sigma-Aldrich | 11268 | 4.7, 6.1 |
Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Sigma-Aldrich | T62200 | 4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3 |
Thiourea (CH4N2S) | Sigma-Aldrich | T8656 | 4.2 |
Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl]) | Sigma-Aldrich | T3253 | 1.4.1, Suppl 1. |
Urea (CH4N2O) | Sigma-Aldrich | U1250 | 4.2 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
B. Enzymes | |||
α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase) | EDM Millipore | 362280 (KP0012) | 3.1 |
β1,4-Galactosidase | EDM Millipore | 362280 (KP0004) | 3.1 |
β-N-Acetylglucosaminidase | EDM Millipore | 362280 (KP0013) | 3.1 |
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C3667 | 3.1 |
Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) | EDM Millipore | 362280 (KP0011) | 3.1 |
Heparinase II | Sigma-Aldrich | H6512 | 3.1 |
Keratanase | Sigma-Aldrich | G6920 | 3.1 |
PNGase-F (N-Glycosidase F) | EDM Millipore | 362280 (KP0001) | 3.5 |
Trypsin | Thermo Scientific | 90057 | 4.7 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
C. Reagent kits | |||
30 kDa MWCO spin filters | Amicon, Millipore | 10256744 | 5.9, Suppl 2 |
Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate | Harvard Apparatus | 74-5657 | 5.1 |
NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels | Thermo-Scientific | NP0322PK2 | Suppl 1 |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | 2.1.3 |
ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit | Merk Millipore | 72103 | 7 |
Tandem mass tag 0 (TMT0) | Thermo Scientific | 900067 | 6.2, 6.3 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
D. Equipment and software | |||
Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300µm, 5µm, 100Å | Thermo Scientific | 160454 | Suppl 3, 4 |
Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75µm, 3µm, 100Å | Thermo Scientific | 164570 | Suppl 3 |
Byonic Search Engine | Protein Metrics | Version 2.9.30 | Suppl 5 |
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano | Thermo Scientific | n/a | Suppl 3, 4 |
EASY-Spray Ion Source | Thermo Scientific | ES081 | Suppl 4 |
EASY-Spray PepMap RSLC C18, 50cm x 75µm, 2μm, 100Å | Thermo Scientific | ES803 | Suppl 4 |
Mascot Search Engine | Matrix Science | Version 2.3.01 | Suppl 3 |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | Suppl 4 |
Proteome Discoverer Software | Thermo Scientific | Version 2.1.1.21 | Suppl 3, 5 |
Picoview Nanospray Source | New Objective | 550 | Suppl 3 |
Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Suppl 3 |
Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | 2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11 |
Scaffold Software | Proteome Software | Version 4.3.2 | Suppl 3 |