Summary

Zebrafish에서의 급성 알코올성 간 손상의 조직 학적 분석

Published: May 25, 2017
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Summary

이 프로토콜은 24 시간 동안 2 % 에탄올로 치료 zebrafish의 유충에서 간 조직 분석을 설명합니다. 이러한 급성 에탄올 처리는 간 지방증 및 간 혈관계의 팽창을 초래한다.

Abstract

알콜 성 간 질환 (ALD)은 급성 또는 만성 알코올 남용으로 인한 간 손상을 의미합니다. 그것은 알코올 관련 이환 및 사망의 주요 원인 중 하나이며 미국에서 2 백만 명이 넘는 사람들에게 영향을 미칩니다. 알콜로 유발 된 간 손상의 근본적인 세포 및 분자 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 ALD에 효과적인 치료법을 개발하는 데 중요합니다. Zebrafish의 유충은 2 % 에탄올에 24 시간 방치 한 후 간 지방증과 섬유화를 나타내어 급성 알코올 중독 손상 연구에 유용합니다. 이 연구는 제브라 피쉬 애벌레에서 급성 에탄올 처리를위한 절차를 설명하고 그것이 간 혈관의 지방증과 붓기를 유발한다는 것을 보여줍니다. 제브라 피쉬 애벌레 간 조직 학적 분석을 위해 최적화 된 Hematoxylin 및 Eosin (H & E) 염색에 대한 자세한 프로토콜도 설명합니다. H & E 얼룩에는 면역 형광보다 몇 가지 독특한 이점이 있습니다.er 세포 및 세포 외 성분을 동시에 검출 할 수 있고 지방증 및 섬유증과 같은 간 손상을 용이하게 검출 할 수있다. 유전 독성 및 바이러스 유발 간 손상 및 유전성 간 질환에 대한 제브라 피쉬 사용의 증가를 감안할 때이 프로토콜은 이러한 모든 연구에서 수행 된 조직 학적 분석을위한 참고 자료로 사용됩니다.

Introduction

알코올 과다 복용으로 인한 알코올 중독 (Alcoholic Liver Disease, ALD)은 알코올과 관련된 이환율 및 사망률의 주요 원인입니다. 미국에서는 간 질환으로 인한 사망의 거의 절반이 알코올 1 을 포함하고 있으며 ALD는 간 이식 3 건 중 거의 1 건을 담당하고 있습니다 2 . ALD는 광범위한 스펙트럼을 가지고 있습니다. 간세포는 과도한 지질 축적으로 특징 지어지며, 과도한 음주의 초기 단계에서 발생하며 알코올 사용을 중단하면 되돌릴 수 있습니다. 유전 적 및 환경 적 요인의 영향과 지속적인 알코올 섭취로 인해 간 지방증은 알콜 성 간염으로 진행될 수 있으며 결국에는 간경변 3이 될 수 있습니다. 설치류 ALD 모델을 이용한 연구는 질병에 대한 상당한 통찰력을 제공해 왔지만 제한이있다 (참고 문헌 3 에서 검토). 알코올 다이어트의 경구 섭취는 설치류에서 지방증을 일으 킵니다 4 ,/ sup> 5 . 염증과 섬유화의 발달에는 침략적이고 기술적 인 도전 인 제 2 모욕 6 , 7 또는 만성 위 내 주입이 필요합니다 8 , 9 . 텔레스트로 제브라 피쉬는 또한 만성 및 급성 알코올 치료 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 에 대한 반응으로 간 손상을 일으 킵니다. 특히, 유생 제브라 피쉬는 급성 알코올성 간 손상 10 , 11 , 13 , 15 를 연구 할 수있는 매력적인 보완 모델 유기체를 대표합니다. 제브라 피쉬 간은 기능적이며 에탄올 대사에 중요한 효소를 4 일까지 생산합니다s post-fertilization (dpf) 13 , 16 , 17. 에탄올은 물에 직접 첨가 할 수 있으며 24 시간 동안 2 % 에탄올에 노출하면 제브라 피쉬 애벌레 13 , 15 에서 간 지방증과 섬유화 반응을 유도하기에 충분합니다.

24 시간 동안 2 % 에탄올로 처리하면 제브라 피쉬 애벌레에서 조직 에탄올 농도가 80 mM이되는 것으로보고되었습니다. 다른 사람들은 애벌레가이 농도를 용인하고 처리 된 동물에서 보이는 간 표현형이 에탄올 노출에 특유하다는 것을 보여주었습니다 11 , 13 , 15 , 18 . 그러나 80 mM은 사람에게 거의 치사되기 때문에 에탄올 처리 된 제브라 피쉬의 간 조직학을 평가하고인간과 생리적 인 연관성을 찾으십시오.

빠른 제브라 피쉬 애벌레의 외부 발달과 반투명은 실시간 및 고정 표본에서 간 내의 알코올 작용을 특성화하는 것을 가능하게합니다. 세포 유형 특이 적 형광 형질 전환 계통의 이용 가능성과 공 촛점 현미경 검사법의 최근 진보는 급성 에탄올 치료 11,15에 대한 반응으로 간세포 유형이 형태 및 행동을 어떻게 변화시키는 지에 대한 연구를 용이하게한다. 그러나 형광 형질 감염 제브라 피쉬의 공 촛점 이미징은 간 조직학을 연구 할 때 Hematoxylin과 Eosin (H & E) 염색을 완전히 대체 할 수 없습니다. 트랜스 제닉 제브라 피쉬를 사용하여 모든 간 세포 유형을 동시에 표시하려면 개개의 트랜스 제닉 라인을 생성해야하며, 각 트랜스 제닉 라인은 고유 한 형광 단이있는 간 세포 유형을 표시합니다. 같은 물고기에 다른 형질 전환 배경을 도입하는 것은 breedin을 필요로한다.g 세대가 필요하며, 이는 많은 시간과 비용이 소요됩니다. 세포 외 기질 성분을 검출하기 위해서는 추가적인 면역 형광 염색이 필요합니다. 반면에 H & E 염색법은 모든 간세포 유형과 세포 외 기질 성분을 동시에 표시하여 간의 개요를 제공합니다 20 . 또한 간세포 폐사, 지방증, 섬유증과 같은 간 질환의 여러 병리학 적 특징을 쉽게 알 수 있습니다. H & E는 포유류의 간 조직학에서 일상적인 얼룩이지만, 제브라 피쉬 간 연구에 일반적으로 사용되지는 않으며 프로토콜이 잘 확립되지 않습니다.

이 연구는 제브라 피쉬 애벌레에서의 급성 에탄올 처리 및 H & E 염색을 사용한 후속 조직 검사를위한 프로토콜을 설명합니다. H & E 염색 프로토콜은 간 개발 및 기능에 대한 모든 연구에 사용될 수 있습니다. 또한, 파라핀 절편은 면역 조직 화학뿐만 아니라 다른 특수한 역에 사용될 수 있습니다trichrome stain, reticulin stain 간 병리학 적 특징.

Protocol

AB WT 성인 및 애벌레 제브라 피쉬는 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서 (National Institutes of Health 간행물 86-23, 개정 1985)에 따라 표준 조건 21 에 따라 유지되었다. 그들의 사용은 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 1. 솔루션 준비 계란 물을 준비하십시오. 상업용 해염 40g…

Representative Results

10 % 완충 포르말린과 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)는 조직학 관행에 사용되는 가장 보편적 인 고정물의 두 가지입니다. 그러나, 그들은 제브라 피쉬 간 조직에 대한 최적의 고정 결과를 제공하지 않습니다 ( 그림 1 및 표 1 ). 10 % 포르말린 또는 4 % PFA로 고정하면 수축이 생겨 간과 주변 조직 사이에 큰 틈이 생깁니다 ( 그림 1A…

Discussion

현재의 프로토콜은 제브라 피쉬 애벌레에서의 급성 에탄올 처리 및 H & E 염색으로 인한 조직 병리학 적 분석을위한 상세한 절차를 기술한다. 급성 에탄올 치료는 제브라 피쉬 간이 알코올 대사 효소를 발현하기 시작하기 때문에 수정 후 96 시간 이내에 시행해야합니다 13 . 2 % 에탄올은 유충이 13 , 14 를 견딜 수있는 최대 투여 량입니…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 Zebrafish International Resource Center의 Dr. Katy Murray를 인정하고자합니다. 프로토콜에 대한 도움을 준 CCHMC의 Stacey Huppert 박사와 Kari Huppert 박사; 및 CCHMC 수의 진료 서비스를 제공합니다. 이 연구는 NIH 보조금 R00AA020514와 CCHMC의 소아과 유전체 센터 (CY) 연구 보조금에 의해 지원되었습니다. 그것은 또한 신시내티의 소화기 질환 연구 핵심 센터의 NIH 교부금 P30 DK078392 (통합 형태 골격)에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

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Cite This Article
Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

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