Análisis histológicos de lesiones hepáticas alcohólicas agudas en peces cebra

La enfermedad hepática alcohólica (ALD), que es causada por el consumo excesivo de alcohol, es una causa importante de morbilidad y mortalidad relacionadas con el alcohol. En los Estados Unidos, casi la mitad de las muertes por enfermedad hepática implican alcohol ¹ , y ALD es responsable de casi 1 de cada 3 trasplantes de hígado [ ^2] . ALD tiene un amplio espectro. La esteatosis, que se caracteriza por un exceso de acumulación de lípidos en los hepatocitos, se produce en la etapa temprana del consumo intensivo de alcohol y es reversible al cesar el consumo de alcohol. Bajo la influencia de factores genéticos y ambientales y la ingesta continua de alcohol, la esteatosis hepática puede progresar a la hepatitis alcohólica y, finalmente, la cirrosis ³ . Los estudios que usan los modelos ALD de roedores han aportado ideas sustanciales sobre la enfermedad, pero tienen limitaciones (revisadas en la referencia ³ ). La alimentación oral de una dieta con alcohol sólo causa esteatosis en roedores ^{4 , <}/ Sup> ⁵ . El desarrollo de la inflamación y la fibrosis requiere un segundo insulto ^{6 , 7} o una infusión intragástrica crónica, que es invasiva y técnicamente desafiante ^{8 , 9} . El pez cebra teleósteo también desarrolla lesión hepática en respuesta al tratamiento de alcohol crónico y agudo ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15} . En particular, el pez cebra larvario representa un organismo modelo complementario atractivo en el que estudiar la lesión hepática alcohólica aguda ^{10 , 11 , 13 , 15} . El hígado de pez cebra es funcional y produce enzimas clave para el metabolismo del etanol por 4 días(Dpf) ^{13 , 16 , 17. El} etanol se puede añadir directamente al agua y la exposición a etanol al 2% durante 24 h es suficiente para inducir esteatosis hepática y respuestas fibrogénicas en larvas de pez cebra 13,15.

Se ha informado de que el tratamiento con etanol al 2% durante 24 h dio lugar a una concentración de etanol de tejidos de 80 mM en larvas de pez cebra [ ^13] . Otros han demostrado que las larvas toleran esta concentración y los fenotipos hepáticos observados en los animales tratados son específicos de la exposición al etanol ^{11 , 13 , 15 , 18} . Sin embargo, debido a que 80 mM es casi letal en los seres humanos ¹⁹ , es importante evaluar la histología del hígado de zebrafish tratado con etanol y deteDeterminar la relevancia fisiológica para los seres humanos.

El rápido desarrollo externo y la translucencia de las larvas de pez cebra permiten caracterizar la acción del alcohol en el hígado en tiempo real y en muestras fijas. La disponibilidad de líneas transgénicas fluorescentes específicas del tipo de célula y los recientes avances en microscopía confocal facilitan el estudio de cómo diferentes tipos de células hepáticas cambian su morfología y comportamiento en respuesta al tratamiento agudo con etanol ^{11 , 15} . Sin embargo, la imagen confocal del pez cebra transgénico fluorescente no puede sustituir por completo a la tinción con hematoxilina y eosina (H & E) cuando se estudia la histología del hígado. La marcación de todos los tipos de células hepáticas al mismo tiempo utilizando transgénicos pez cebra requiere la generación de líneas transgénicas individuales, cada una de las etiquetas de un tipo de células del hígado con un único fluoróforo. Introducción de diferentes fondos transgénicos en el mismo pez requiere breedinG generaciones múltiples, lo cual requiere mucho tiempo y es costoso. Se necesita tinción de inmunofluorescencia adicional para detectar componentes de la matriz extracelular. Por otro lado, la tinción con H & E marca simultáneamente todos los tipos de células hepáticas y componentes de la matriz extracelular, proporcionando así una visión general del hígado ²⁰ . Además, revela fácilmente varios rasgos histopatológicos de enfermedades hepáticas, tales como muerte hepatocitaria, esteatosis y fibrosis. Aunque H & E es una mancha de rutina en la histología del hígado de mamíferos, no se utiliza comúnmente en la investigación del hígado de pez cebra, y el protocolo está menos bien establecido.

Este trabajo describe un protocolo para el tratamiento de etanol agudo en larvas de pez cebra y para el seguimiento de los análisis histológicos con tinción de H & E. El protocolo de tinción de H & E puede utilizarse en todos los estudios sobre el desarrollo y la función del hígado. Además, las secciones de parafina pueden utilizarse para inmunohistoquímica, así como para otrasIns en la patología hepática, incluyendo la tinción tricrómica, tinción reticulina, etc.