Гистологический анализ острой алкогольной травмы печени у данио
Summary
Этот протокол описывает гистологические анализы печени у личинок рыбок данио, которые обрабатывались 2% -ным этанолом в течение 24 часов. Такая обработка острым этанолом приводит к стеатозу печени и набуханию печеночной сосудистой сети.
Abstract
Алкогольная болезнь печени (ALD) относится к повреждению печени из-за острого или хронического злоупотребления алкоголем. Это одна из ведущих причин заболеваемости и смертности от алкоголя и затрагивает более 2 миллионов человек в Соединенных Штатах. Лучшее понимание клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе алкогольной травмы печени, имеет решающее значение для разработки эффективного лечения ALD. Личинки данио вызывают печеночный стеатоз и фиброгенез через 24 ч воздействия 2% -ного этанола, что делает их полезными для изучения острого алкогольного поражения печени. В данной работе описывается процедура лечения острым этанолом у личинок рыбок данио и показано, что он вызывает стеатоз и опухание печеночных кровеносных сосудов. Также описан детальный протокол окрашивания гематоксилин-эозином (H & E), который оптимизирован для гистологического анализа личиночной печени рыбок данио. Окрашивание H & E имеет ряд уникальных преимуществ по сравнению с иммунофлуоресценцией, так как оно означает все живоеЭритроциты и внеклеточные компоненты одновременно и могут легко обнаруживать повреждение печени, такое как стеатоз и фиброз. Учитывая увеличение использования данио в моделировании токсина и вызванного вирусом повреждения печени, а также наследственных заболеваний печени, этот протокол служит справочным материалом для гистологического анализа, проведенного во всех этих исследованиях.
Introduction
Алкогольная болезнь печени (ALD), вызванная чрезмерным потреблением алкоголя, является основной причиной заболеваемости и смертности от алкоголизма. В Соединенных Штатах почти половина смертей от заболеваний печени связана с алкоголем 1 , и ALD отвечает за почти 1 из 3 трансплантаций печени 2 . ALD имеет широкий спектр. Стеатоз, который характеризуется избыточным накоплением липидов в гепатоцитах, встречается на ранней стадии интенсивного питья и обратимо при прекращении употребления алкоголя. Под влиянием генетических и экологических факторов и продолжающимся потреблением алкоголя стеатоз печени может прогрессировать до алкогольного гепатита и, в конечном счете, цирроза 3 . Исследования с использованием моделей грызунов ALD обеспечили существенное понимание болезни, но они имеют ограничения (см. Ссылку 3 ). Устное питание от алкогольной диеты вызывает только стеатоз у грызунов 4 , </ Sup> 5 . Развитие воспаления и фиброза требует либо второго инсульта 6 , 7, либо хронического внутрижелудочного вливания, которое является инвазивным и технически сложным 8 , 9 . Телео данио также развивает повреждение печени в ответ на хроническое и острое лечение алкоголизмом 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . В частности, личиночные рыбки данио представляют собой привлекательный дополнительный модельный организм, в котором изучается острая алкогольная травма печени 10 , 11 , 13 , 15 . Печень данио является функциональной и производит ключевые ферменты для метаболизма этанола к 4-му дню(Dpf) 13 , 16 , 17. Этанол может быть непосредственно добавлен в воду, а воздействие на 2% этанола в течение 24 ч является достаточным для индуцирования печеночного стеатоза и фиброгенных реакций у личинок рыбок данио 13,15.
Сообщалось, что обработка 2% этанола в течение 24 ч приводила к концентрации тканевого этанола 80 мМ у личинок рыбок данио 13 . Другие показали, что личинки переносят эту концентрацию, и фенотипы печени, наблюдаемые у обработанных животных, специфичны для воздействия этанола 11 , 13 , 15 , 18 . Тем не менее, поскольку 80 мМ почти смертельно для людей 19 , важно оценить гистологию печени обработанных этанолом рыбок данио и детейRmine физиологическое отношение к людям.
Быстрое внешнее развитие и просвечивание личинок рыбок данио позволяют характеризовать действие алкоголя в печени в режиме реального времени и в фиксированных образцах. Доступность флуоресцентных трансгенных линий, специфичных для клеточного типа, и последние достижения в конфокальной микроскопии облегчают изучение того, как различные типы клеток печени изменяют свою морфологию и поведение в ответ на лечение острым этанолом 11,15. Однако конфокальная визуализация флуоресцентного трансгенного данио не может полностью заменить окрашивание гематоксилин-эозином (H & E) при исследовании гистологии печени. Маркировка всех типов клеток печени одновременно с использованием трансгенных рыбок данио требует генерации отдельных трансгенных линий, каждая из которых маркирует один тип клеток печени уникальным флуорофором. Введение различных трансгенных фоновых условий в одну и ту же рыбу требует разведенияG нескольких поколений, что требует больших затрат времени и затрат. Дополнительное окрашивание иммунофлуоресценции необходимо для обнаружения компонентов внеклеточного матрикса. С другой стороны, окрашивание H & E одновременно маркирует все типы клеток печени и компоненты внеклеточного матрикса, таким образом обеспечивая обзор печени 20 . Более того, он легко обнаруживает несколько гистопатологических признаков заболеваний печени, таких как смерть гепатоцитов, стеатоз и фиброз. Хотя H & E является обычным пятном в гистологии печени млекопитающих, оно обычно не используется в исследованиях печени рыбок данио, а протокол менее хорошо известен.
Эта работа описывает протокол для обработки острым этанолом у личинок рыбок данио и для последующего гистологического анализа с окрашиванием H & E. Протокол окрашивания H & E может использоваться во всех исследованиях развития и функционирования печени. Кроме того, парафиновые срезы могут быть использованы для иммуногистохимии, а также для других специальных исследованийIns в патологии печени, включая пятно трихрома, окрашивание ретитулина и т . Д.
Protocol
Representative Results
Discussion
Текущий протокол описывает подробную процедуру для обработки острым этанолом у личинок рыбок данио и последующие гистопатологические анализы с окрашиванием H & E. Острая обработка этанолом должна проводиться не ранее чем через 96 ч после оплодотворения, так как на этой стадии печень ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность д-ру Кэти Мюррей в Международном ресурсном центре Zebrafish; Д-р Стейси Хапперт и Кари Хапперт в CCHMC за их полезные советы по протоколу; И ветеринарная служба CCHMC, для ухода за рыбой. Эта работа была поддержана грантом NIH R00AA020514 и исследовательским грантом от Центра детской геномики в CCHMC (до CY). Кроме того, он частично поддерживался грантом NIH P30 DK078392 (Интегративное морфологическое ядро) Центра сердечно-сосудистых заболеваний в Цинциннати.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
