التحاليل النسيجية لإصابات الكبد الكحولية الحادة في الزرد
Summary
يصف هذا البروتوكول التحليلات النسيجية للكبد من اليرقات الزرد التي تم علاجها مع الايثانول 2٪ لمدة 24 ساعة. هذه النتائج العلاج الإيثانول الحاد في دهن الكبد وتورم في الأوعية الدموية الكبدية.
Abstract
يشير مرض الكبد الكحولي (ألد) إلى تلف الكبد بسبب تعاطي الكحول الحاد أو المزمن. وهو من بين الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات المرتبطة بالكحول ويؤثر على أكثر من 2 مليون شخص في الولايات المتحدة. فهم أفضل للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء إصابة الكبد الناجم عن الكحول أمر حاسم لتطوير علاج فعال ل ألد. تعرض اليرقات الزرد الدهنية الكبدية و فيبروجينيسيس بعد 24 ساعة فقط من التعرض للإيثانول 2٪، مما يجعلها مفيدة لدراسة إصابة الكبد الكحولية الحادة. هذا العمل يصف الإجراء لعلاج الإيثانول الحاد في اليرقات الزرد ويظهر أنه يسبب تشحم وتورم في الأوعية الدموية الكبدية. ويرد وصف بروتوكول مفصل لهيماتوكسيلين ويوسين (H & E) تلطيخ التي هي الأمثل للتحليل النسيجي للكبد اليرقات الزرد، كما وصف. H & E تلطيخ لديه العديد من المزايا الفريدة على المناعي، كما أنه يصادف كل حيالخلايا إر والمكونات خارج الخلية في وقت واحد، ويمكن بسهولة الكشف عن إصابة الكبد، مثل الدهن والتليف. نظرا لزيادة استخدام الزرد في النمذجة السم والفيروسات الناجم عن إصابة الكبد، وكذلك أمراض الكبد الموروثة، وهذا البروتوكول بمثابة مرجعا للتحليلات النسيجية التي أجريت في جميع هذه الدراسات.
Introduction
مرض الكبد الكحولية (ألد)، والذي يسببه الإفراط في استهلاك الكحول، هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات المرتبطة بالكحول. في الولايات المتحدة، ما يقرب من نصف الوفيات أمراض الكبد تنطوي على الكحول 1 ، و ألد هو المسؤول عن ما يقرب من 1 في 3 زرع الكبد 2 . ألد لديها طيف واسع. داء الدهن، الذي يتميز بزيادة تراكم الدهون في خلايا الكبد، ويحدث في مرحلة مبكرة من شرب الخمر ويمكن عكسها عند التوقف عن استخدام الكحول. تحت تأثير العوامل الوراثية والبيئية والاستمرار في تناول الكحول، يمكن أن يتقدم الدهن الكبدي إلى التهاب الكبد الكحولي، وفي نهاية المطاف، تليف الكبد 3 . وقد وفرت الدراسات باستخدام نماذج ألد القوارض رؤى كبيرة في هذا المرض، ولكن لديهم قيود (استعرض في المرجع 3 ). التغذية عن طريق الفم من اتباع نظام غذائي كحولي يسبب فقط التعرق في القوارض 4 ، </ سوب> 5 . تطوير الالتهاب والتليف يتطلب إما الإهانة الثانية 6 ، 7 أو التسريب داخل المعدة المزمن، وهو الغازية والتحدي من الناحية الفنية 8 ، 9 . الزرد عن بعد أيضا يتطور إصابة الكبد ردا على كل من علاج الكحول المزمن والحاد 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 . على وجه الخصوص، يمثل الزرد اليرقات كائن نموذج التكميلية جذابة التي لدراسة إصابة الكبد الكحولية الحادة 10 ، 11 ، 13 ، 15 . الكبد الزرد وظيفية وتنتج الانزيمات الرئيسية لالايضان الايثانول من قبل 4 أيامs بعد الإخصاب (دب) 13 ، 16 ، 17. الإيثانول يمكن أن تضاف مباشرة إلى الماء، والتعرض إلى 2٪ من الإيثانول لمدة 24 ساعة كافية للحث على دهن الكبد واستجابات فيبروجينيك في اليرقات الزرد 13 ، 15 .
وقد أفيد أن العلاج مع 2٪ من الإيثانول لمدة 24 ساعة أسفرت عن تركيز الايثانول الأنسجة من 80 ملي في اليرقات الزرد 13 . وأظهر آخرون أن اليرقات تتسامح مع هذا التركيز والنماذج الظاهرية الكبد ينظر في الحيوانات المعالجة هي محددة لتعرض الإيثانول 11 ، 13 ، 15 ، 18 . ومع ذلك، لأن 80 ملي هو قاتلة تقريبا في البشر 19 ، فمن المهم لتقييم الأنسجة الكبد من الزرد المعالجة الإيثانول و ديترمين صلة الفسيولوجية للبشر.
التطور الخارجي السريع وترجمة اليرقات الزرد تجعل من الممكن لتوصيف عمل الكحول داخل الكبد في الوقت الحقيقي وفي عينات ثابتة. توافر خطوط الخلايا المعدلة وراثيا الفلورسنت نوع معين والتطورات الأخيرة في المجهر متحد البؤر تسهل دراسة كيف تختلف أنواع خلايا الكبد المختلفة مورفولوجيا والسلوك ردا على العلاج الإيثانول الحاد 11 ، 15 . ومع ذلك، والتصور متحد البؤر من الزرد المعدلة وراثيا الفلورسنت لا يمكن أن يكون بديلا تماما عن الهيماتوكسيلين ويوسين (H & E) تلطيخ عند دراسة الأنسجة الكبد. وضع علامات على جميع أنواع الخلايا الكبد في نفس الوقت باستخدام الزرد المعدلة وراثيا يتطلب توليد خطوط المعدلة وراثيا الفردية، كل وصفها نوع واحد من خلايا الكبد مع فلورفور فريدة من نوعها. إدخال خلفيات المعدلة وراثيا مختلفة في نفس السمك يتطلب بريدينز الأجيال المتعددة، التي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. هناك حاجة إلى تلطيخ المناعي إضافية للكشف عن مكونات المصفوفة خارج الخلية. H & E تلطيخ، من ناحية أخرى، تسميات في وقت واحد جميع أنواع الخلايا الكبد ومكونات مصفوفة خارج الخلية، وبالتالي توفير لمحة عامة عن الكبد 20 . وعلاوة على ذلك، فإنه يكشف بسهولة العديد من الميزات النسيجية المرضية لأمراض الكبد، مثل موت الخلايا الكبدية، والدهون، والتليف. على الرغم من أن H & E هو وصمة عار روتينية في الأنسجة الكبدية الثدييات، فإنه لا يشيع استخدامها في البحوث الكبد الزرد، والبروتوكول هو أقل رسوخا.
يصف هذا العمل بروتوكول لعلاج الإيثانول الحاد في اليرقات الزرد والتحليل النسيجي المتابعة مع H & E تلطيخ. H & E تلطيخ بروتوكول يمكن استخدامها في جميع الدراسات من تطور الكبد وظيفة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام أقسام البارافين ل إمونوهيستوشيميستري، فضلا عن ستا خاصة أخرىفي أمراض الكبد، بما في ذلك وصمة عار ثلاثية الألوان، وصمة عار ريتيكولين، الخ .
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول الحالي إجراء مفصل لعلاج الإيثانول الحاد في اليرقات الزرد والتحليلات النسيجية اللاحقة مع H & E تلطيخ. وينبغي إجراء العلاج الإيثانول الحاد في أي وقت مضى من 96 ساعة بعد الإخصاب، وهذه هي المرحلة التي يبدأ الكبد الزرد للتعبير عن انزيمات الكحول استقلاب <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور كاتي موراي في مركز الموارد الدولية الزرد؛ الدكتور ستاسي هوبرت وكاري هوبيرت في كشمك، للحصول على مشورة مفيدة بشأن البروتوكول؛ والخدمة البيطرية لشمك، لرعاية الأسماك. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R00AA020514 ومنحة بحثية من مركز علم الجينوم الأطفال في كشمك (إلى قبرصي). كما كان الدعم في جزء منه من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة P30 DK078392 (التكاملية مورفولوجيا الأساسية) من المركز الأساسي لبحوث أمراض الجهاز الهضمي في سينسيناتي.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
