استخراج وتنقية البوليفينول من تجميد المجفف بيري مسحوق لعلاج خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية<em> في المختبر</em
Summary
هذا العمل تفاصيل طريقة خطوة بخطوة لإعداد مقتطفات الغنية بالبوليفينول من مسحوق التوت المجففة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر وصفا دقيقا لكيفية استخدام هذه المستخلصات الغنية بوليفينول في ثقافة الخلية في وجود هرمون الببتيد أنجيوتنسين الثاني (أنغ الثاني) باستخدام خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية (فسمكس).
Abstract
وتشير الدراسات الوبائية إلى أن زيادة تناول الفلافونويد يرتبط بانخفاض معدل الوفيات بسبب أمراض القلب والأوعية الدموية في الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) وأوروبا. وتستهلك التوت على نطاق واسع في الولايات المتحدة ولديها محتوى بوليفينوليكي عالي. وقد تبين أن البوليفينول تتفاعل مع العديد من الأهداف الجزيئية وممارسة العديد من الوظائف البيولوجية الإيجابية، بما في ذلك الآثار المضادة للأكسدة، المضادة للالتهابات، والقلبية. البوليفينول معزولة من بلاك بيري (بل)، التوت (رب)، التوت الأسود (برب) تقليل الإجهاد التأكسدي والشيخوخة الخلوية ردا على أنجيوتنسين الثاني (أنغ الثاني). يوفر هذا العمل وصفا تفصيليا للبروتوكول المستخدم لإعداد مقتطفات البوليفينول من التوت المجففة التجميد. وقد أجريت الاستخلاصات من البوليفينول من مسحوق التوت المجففة باستخدام 80٪ من الإيثانول المائي وطريقة الاستخلاص بمساعدة الموجات فوق الصوتية. كما تم تنقية المستخلص الخام وتجزئته باستخدام الكلوروفورم وأسيتات الإيثيل،على التوالي. تم اختبار آثار كل من المستخلصات الخام والمنقى على خلايا العضلات السلسية الوعائية (فسمكس) في الثقافة.
Introduction
البوليفينول هي مركبات تحتوي على حلقة الفينول واحدة على الأقل في هيكلها وهي موجودة بوفرة في المملكة النباتية 1 . وقد استهلك البشر النباتات لآلاف السنين لأغراض طبية دون أن يكون على بينة من وجود مثل هذه المركبات 2 . العديد من الفواكه والخضروات لديها بعض المركبات بوليفينوليك المشتركة، وإن كان بكميات مختلفة، بما في ذلك الفلافونويد، ستيلبينس، والأحماض الفينولية 3 . على الرغم من أن البوليفينول غالبا ما ترتبط مع الفواكه والخضروات الملونة، وهذا ليس صحيحا تماما. على سبيل المثال، زياكسانثين و زانثين موجودة في الخضروات التي ليست ملونة للغاية، مثل البصل والثوم، والتي هي من عائلة البصل الأخضر وترتبط مع العديد من الفوائد الصحية 4 . وبصرف النظر عن كونها مرتبطة مع العديد من الفوائد الصحية 5 ، البوليفينول أيضا خدمة النباتات من خلال حمايتهم من الحشرات أد الأشعة فوق البنفسجية 2 . بوليفينول عادة ما توجد في النظام الغذائي البشري وتعتبر مضادات الأكسدة القوية، لأنها يمكن أن تكشف أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) 6 ، 7 ، 8 . لديهم أيضا المضادة للالتهابات 9 ، مضادات الميكروبات 10 ، ومكافحة ارتفاع ضغط الدم 11 ، ومضادة للسرطان 12 ، 13 خصائص.
وتظهر الدراسات الوبائية وجود علاقة عكسية بين استهلاك الفلافونويد وأمراض القلب والأوعية الدموية (الأمراض القلبية الوعائية) حدوث 16 و 17 والوفيات 14 ، 15 . وتستهلك التوت على نطاق واسع في الولايات المتحدة ولديها كميات عالية من البوليفينول، بما في ذلك الفلافونويدات. على سبيل المثال، استهلاك بلاك بيري (بل) عصير (300 مل / د) لمدة ثمانية أسابيع انخفاض كبير في ضغط الدم الانقباضي في مرضى دسليبيدميك 18 . جيونغ وآخرون. 19 أن الرجال والنساء قبل ارتفاع ضغط الدم تستهلك 2.5 غرام من التوت الأسود (برب) استخراج يوميا كان أقل 24 ساعة وضغط الدم ليلا مقارنة مع أولئك الذين يتناولون الدواء الوهمي. التوت (رب) انخفاض ضغط الدم مع زيادة التعبير عن ديسموتاز الفائق (سود) في الفئران ارتفاع ضغط الدم بشكل عفوي 20 . وقد تبين مؤخرا أن بل، رب، و برب تقلل من مستويات روس و الشيخوخة الناجمة عن أنجيوتنسين الثاني (أنغ الثاني) في خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية (فسمكس) 21 . وبالإضافة إلى ذلك، فإن جزء الأنثوسيانين من مستخلص بل يقلل من التعبير عن محفز سينتاز أكسيد النيتريك (إينوس)، وحول دون نشاط العامل النووي كابا B (نف-κB) و كيناز الذي ينظم إشارة إشارة (إرك) في عديد السكاريد الشحمي (لس) J774 الخلاياأس = "كريف"> 22. استخراج برب انخفض تفعيل نف-κB والأكسدة الحلقية 2 (كوكس-2) التعبير في المختبر 23 ، وتحسين الشخصية الدهون، ومنع تشكيل تصلب الشرايين في الفئران تغذية نظام غذائي عالي الدهون 24 . الأنثوسيانين، التي تعتبر الفلافونويدات الأكثر وفرة في التوت، وتعديل الاستجابة الالتهابية في لس-راو 264.7 الضامة عن طريق خفض إنتاج الورم نخر عامل ألفا (تنف-α) 25 والحد من انتشار وهجرة فسمكس 26 .
وبما أن هناك اهتماما متزايدا بفهم دور البوليفينول في صحة الإنسان والمرض، فمن المهم لتحسين طريقة الاستخراج. ويستخدم على نطاق واسع استخراج المذيبات لهذا الغرض، لأنها فعالة من حيث التكلفة وسهولة استنساخه. في هذه الدراسة، تم استخدام استخراج المذيبات مع الإيثانول، جنبا إلى جنب مع الاستخراج بمساعدة الموجات فوق الصوتيةn، الذي تم تكييفه من كيم و لي 27 . تم إجراء تنقية وتجزئة المستخلصات الخام باستخدام الكلوروفورم وأسيتات الإيثيل للحصول على جزء المستخلص المنقى (بي) الذي تم تعديله من كيويرز وآخرون 28 . وعلاوة على ذلك، تمت مقارنة فعالية مستخلصات البوليفينول الخام مقابل المنقى من بل في الحد من الفسفرة القاعدية ل ERK1 / 2، وتم تقديم أمثلة تمثيلية للتأثير المثبط لمستخلص بوليفينول بل المنقى على أنغ-إنغوسد سيغنالينغ ديسكونتس في فسمكس.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحتوي البوليفينول المعزول من التوت على تركيبات متميزة. بروتوكول الاستخلاص القائم على الإيثانول وصف هنا يسمح لتحديد مستويات مختلفة من الأحماض الفينولية والفلافونويد الموجودة في مستخلصات البوليفينول الخام وتنقيته من بل ( الجدول 1 ). تم إثراء سي في حمض الغالي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (14GRNT20180028) ومجلس ولاية ولاية فلوريدا للبحوث والإبداع (كوفرس).
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
- Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions–a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
- Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
- Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
- Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
- Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity?. Crit Rev Food Sci Nutr. 56, S46-S59 (2016).
- Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
- Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
- Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
- Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
- Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
- Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
- Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
- Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
- Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
- Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
- Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
- Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
- Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
- Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
- Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
- Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
- Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
- Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
- Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, 2.1-2.12 (2002).
- Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
- Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
- Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).
