Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver zur Behandlung von vaskulären glatten Muskelzellen<em> In vitro</em
Summary
Diese Arbeit beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Herstellung von Polyphenol-reichen Extrakten aus gefriergetrockneten Beerenpulver. Darüber hinaus gibt es eine gründliche Beschreibung der Verwendung dieser Polyphenol-reichen Extrakte in der Zellkultur in Gegenwart des Peptidhormons Angiotensin II (Ang II) unter Verwendung von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs).
Abstract
Epidemiologische Studien zeigen, dass eine erhöhte Flavonoidaufnahme mit einer verminderten Mortalität aufgrund von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) in den USA (USA) und Europa korreliert. Beeren sind in den USA weit verbreitet und haben einen hohen Polyphenolgehalt. Es wurde gezeigt, dass Polyphenole mit vielen molekularen Targets in Wechselwirkung treten und zahlreiche positive biologische Funktionen ausüben, darunter antioxidative, entzündungshemmende und kardioprotektive Effekte. Polyphenole, die aus Brombeeren (BL), Himbeere (RB) und schwarzer Himbeere (BRB) isoliert wurden, reduzieren den oxidativen Stress und die zelluläre Seneszenz als Reaktion auf Angiotensin II (Ang II). Diese Arbeit liefert eine detaillierte Beschreibung des Protokolls zur Herstellung der Polyphenolextrakte aus gefriergetrockneten Beeren. Polyphenol-Extraktionen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver wurden unter Verwendung von 80% igem wässrigem Ethanol und einem Ultraschall-unterstützten Extraktionsverfahren durchgeführt. Der Rohextrakt wurde weiter gereinigt und mit Chloroform und Ethylacetat fraktioniert,beziehungsweise. Die Effekte von sowohl rohen als auch gereinigten Extrakten wurden an vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in Kultur getestet.
Introduction
Polyphenole sind Verbindungen, die mindestens einen phenolischen Ring in ihrer Struktur enthalten und im Pflanzenreich reichlich vorhanden sind. Menschen verbrauchen Pflanzen seit Jahrtausenden für medizinische Zwecke, ohne sich der Existenz solcher Verbindungen bewusst zu sein 2 . Viele Früchte und Gemüse haben einige geteilte polyphenolische Verbindungen, wenn auch mit unterschiedlichen Mengen, einschließlich Flavonoide, Stilbene und Phenolsäuren 3 . Obwohl Polyphenole oft mit bunten Früchten und Gemüse verbunden sind, ist dies nicht strikt wahr. Zum Beispiel sind Zeaxanthin und Xanthin in Gemüse, die nicht sehr bunt sind, wie Zwiebeln und Knoblauch, die aus der Familie der Schalotten sind und sind mit zahlreichen gesundheitlichen Vorteile verbunden 4 vorhanden . Abgesehen davon, dass sie mit mehreren gesundheitlichen Vorteilen verbunden sind, dienen Polyphenole auch Pflanzen, indem sie sie vor Insekten schützenD Ultraviolettstrahlung 2 . Polyphenole werden häufig in der menschlichen Ernährung gefunden und gelten als leistungsstarke Antioxidantien, da sie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 6 , 7 , 8 fangen können. Sie haben auch entzündungshemmende 9 , antimikrobielle 10 , antihypertensive 11 und anti-karzinogene 12 , 13 Eigenschaften.
Epidemiologische Studien zeigen eine umgekehrte Assoziation zwischen dem Verzehr von Flavonoiden und Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) Inzidenz 16 , 17 und Mortalität 14 , 15 . Beeren sind in den USA weit verbreitet und haben hohe Mengen an Polyphenolen, einschließlich Flavonoide. Zum Beispiel, Verbrauch von Brombeere (BL) Saft (300 ML / d) für acht Wochen signifikant den systolischen Blutdruck bei dyslipidämischen Patienten verringert 18 . Jeong et al. 19 berichteten, dass vorhypertensive Männer und Frauen, die 2,5 g schwarze Himbeere (BRB) Extrakt pro Tag verbrauchen, einen niedrigeren 24-Stunden- und Nacht-Blutdruck im Vergleich zu denen hatten, die ein Placebo verbrauchten. Himbeeren (RB) verringerten den Blutdruck bei gleichzeitiger Erhöhung der Expression von Superoxid-Dismutase (SOD) bei spontan hypertensiven Ratten 20 . Es wurde kürzlich gezeigt, dass BL, RB und BRB die Niveaus von ROS und Seneszenz reduzieren, die durch Angiotensin II (Ang II) in vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) induziert werden. Darüber hinaus reduzierte die Anthocyaninfraktion aus BL-Extrakt die Expression der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS) und hemmte die Aktivität von Nuklearfaktor kappa B (NF- & kgr; B) und extrazellulärer signalregulierter Kinase (ERK) in Lipopolysaccharid (LPS) -stimuliert J774-ZellenAss = "xref"> 22 BRB-Extrakte verringerten die NF-κB-Aktivierung und die Cyclooxygenase 2 (COX-2) -Expression in vitro 23 , verbesserten das Lipidprofil und verhinderten die Bildung von Atherosklerose-Läsionen bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät versorgt wurden. Anthocyanine, die als die häufigsten Flavonoide in Beeren angesehen werden, modulieren die Entzündungsreaktion in LPS-stimulierten RAW 264.7-Makrophagen durch Verringerung der Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α) -Produktion 25 und verringern die Proliferation und Migration von VSMCs 26 .
Da es zunehmendes Interesse am Verständnis der Rolle der Polyphenole in der menschlichen Gesundheit und Krankheit gibt, ist es wichtig, die Extraktionsmethode zu optimieren. Die Lösemittel-Extraktion wird hierfür weit verbreitet, da sie kostengünstig und leicht reproduzierbar ist. In dieser Studie wurde eine Lösungsmittelextraktion mit Ethanol, zusammen mit einem Ultraschall-unterstützten Extrakt, verwendetN-Methode, die von Kim und Lee 27 angepasst wurde. Die Reinigung und Fraktionierung von Rohextrakten (CE) unter Verwendung von Chloroform und Ethylacetat wurde durchgeführt, um die gereinigte Extrakt (PE) -Fraktion zu erhalten, die von Queires et al. 28 angepasst wurde. Weiterhin wurde die Wirksamkeit von rohen versus gereinigten Polyphenol-Extrakten aus BL bei der Verringerung der basalen Phosphorylierung von ERK1 / 2 verglichen und repräsentative Beispiele für die hemmende Wirkung von gereinigtem BL-Polyphenol-Extrakt auf Ang-II-induzierte Signalisierungsreduktionen in VSMCs wurden bereitgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polyphenole, die aus Beeren isoliert sind, enthalten unterschiedliche Kompositionen. Das hier beschriebene Ethanol-basierte Extraktionsprotokoll ermöglichte die Identifizierung verschiedener Phenolsäuren und Flavonoide, die in rohen und gereinigten Polyphenol-Extrakten von BL vorliegen ( Tabelle 1 ). CE wurde mit Gallussäure, Ferulasäure, 4-O-Caffeochininsäure und 5-O-Caffeoylchininsäure angereichert. Der Reinigungsprozess änderte die Mengen an Gallussäure und p-Cumarsäure nicht signifikant. Al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (14GRNT20180028) und dem Florida State University Council über Forschung und Kreativität (COFRS) finanziert.
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
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