Extractie en zuivering van polyfenolen uit bevroren gedroogde bessenpoeder voor de behandeling van vasculaire gladde spiercellen<em> In Vitro</em
Summary
In dit werk wordt een stap-voor-stap methode beschreven om polyphenolrijke extracten uit gevriesdroogd bessenpoeder te bereiden. Daarnaast biedt het een grondige beschrijving van hoe deze polyphenol-rijke extracten in celkweek kunnen worden gebruikt in aanwezigheid van vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van het peptidehormoon-angiotensine II (Ang II).
Abstract
Epidemiologische studies geven aan dat verhoogde flavonoïdale inname correleert met verminderde sterfte door hart- en vaatziekten (CVD) in de Verenigde Staten (VS) en Europa. Bessen worden in de VS veel gebruikt en hebben een hoge polyfenolische inhoud. Polyfenolen zijn aangetoond dat ze met veel moleculaire doelen interageren en veel positieve biologische functies uitoefenen, waaronder antioxidant, anti-inflammatoire en cardioprotectieve effecten. Polyfenolen geïsoleerd van blackberry (BL), framboos (RB) en zwarte frambozen (BRB) verminderen oxidatieve stress en cellulaire senescentie in reactie op angiotensine II (Ang II). Dit werk geeft een gedetailleerde omschrijving van het protocol dat wordt gebruikt om de polyfenol extracten uit vriesgedroogde bessen te bereiden. Polyfenol-extracties uit bevroren gedroogde bessenpoeder werden uitgevoerd met behulp van 80% waterige ethanol en een met behulp van ultrasoon geassisteerde extractiemethode. Het ruwe extract werd verder gezuiverd en gefractioneerd onder toepassing van chloroform en ethylacetaat,respectievelijk. De effecten van zowel ruwe als gezuiverde extracten werden getest op vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) in cultuur.
Introduction
Polyfenolen zijn verbindingen die tenminste één fenolische ring in hun structuur bevatten en in overvloed aanwezig zijn in het plantenrijk 1 . Mense hebben voor millennia planten verbruikt voor medicinale doeleinden zonder zich bewust te zijn van het bestaan van dergelijke verbindingen 2 . Veel groenten en fruit hebben sommige gedeelde polyfenolische verbindingen, zij het met verschillende hoeveelheden, waaronder flavonoïden, stilbenen en fenolzuren 3 . Hoewel polyfenolen vaak geassocieerd worden met kleurrijke groenten en fruit, is dit niet strikt waar. Zeaxanthine en xanthine zijn bijvoorbeeld aanwezig in groenten die niet zeer kleurrijk zijn, zoals uien en knoflook, die uit de familie van scallions zijn en in verband staan met tal van voordelen voor de gezondheid 4 . Afgezien van geassocieerd met verschillende gezondheidsvoordelen 5 , dienen polyfenolen ook planten door ze te beschermen tegen insecten enD ultraviolette straling 2 . Polyfenolen komen vaak voor in het menselijke dieet en worden beschouwd als krachtige antioxidanten, omdat ze Reactieve Zuurstof Soorten (ROS) 6 , 7 , 8 kunnen afscheiden. Ze hebben ook anti-inflammatoire 9 , antimicrobiële 10 , anti-hypertensieve 11 en anti-carcinogene 12 , 13 eigenschappen.
Epidemiologische studies tonen een omgekeerde associatie tussen de consumptie van flavonoïden en cardiovasculaire aandoeningen (CVD) 16 , 17 en mortaliteit 14 , 15 . Bessen worden in de VS veel gebruikt en hebben grote hoeveelheden polyfenolen, waaronder flavonoïden. Bijvoorbeeld, consumptie van blackberry (BL) sap (300 ML / d) gedurende acht weken significant verminderde systolische bloeddruk bij dyslipidemische patiënten 18 . Jeong et al. 19 meldde dat prehypnotherapie mannen en vrouwen die 2,5 g zwarte frambozen (BRB) per dag consumeren, een lagere 24 uur en nachtelijke bloeddruk hadden vergeleken met die van een placebo. Frambozen (RB) daalden de bloeddruk terwijl de expressie van superoxide dismutase (SOD) bij spontane hypertensieve ratten 20 werd verhoogd. Recent is aangetoond dat BL, RB en BRB de niveaus van ROS en senescentie verminderen die geïnduceerd worden door angiotensine II (Ang II) in Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs) 21 . Daarnaast verminderde de anthocyanine fractie van BL extract de expressie van induceerbaar stikstofoxide synthase (iNOS) en remde de activiteit van Nuclear Factor kappa B (NF-KB) en extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (ERK) in lipopolysaccharide (LPS) gestimuleerde J774 cellenAss = "xref"> 22. BRB-extracten verlaagden de in vitro 23 NF-KB activatie en cyclooxygenase 2 (COX-2) expressie, verbeterde het lipide profiel en verhinderde atherosclerose lesievorming bij muizen die een vet vet dieet 24 voerden. Anthocyaninen, die de meest voorkomende flavonoïden in bessen worden beschouwd, moduleren de ontstekingsreactie in LPS-gestimuleerde RAW 264.7 macrofagen door de productie van Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) 25 te verminderen en de proliferatie en migratie van VSMCs 26 te verminderen .
Aangezien er belangstelling is voor het begrijpen van de rol van polyfenolen bij de gezondheid en de ziekte van de mens, is het belangrijk om de extractiemethode te optimaliseren. Oplosmiddelwinning wordt daarvoor veel gebruikt, omdat het kosteneffectief en makkelijk reproduceerbaar is. In deze studie werd een oplosmiddelxtractie gebruikt met ethanol, samen met een ultrasoon geassisteerde extractioN methode, die is aangepast uit Kim en Lee 27 . De zuivering en fractionering van ruwe extracten (CE) onder toepassing van chloroform en ethylacetaat werden uitgevoerd ter verkrijging van de gezuiverde extract (PE) fractie die werd aangepast uit Queires et al. 28 . Bovendien werden de werkzaamheid van ruwe versus gezuiverde polyfenol-extracten van BL vergeleken bij het reduceren van de basale fosforylering van ERK1 / 2, en representatieve voorbeelden van het remmende effect van gezuiverd BL-polyfenol-extract op Ang II-geïnduceerde signaleringsreducties in VSMC's werden verschaft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polyfenolen geïsoleerd uit bessen bevatten duidelijke composities. Het hier beschreven ethanol-gebaseerde extractieprotocol is toegestaan voor het identificeren van verschillende niveaus van fenolzuren en flavonoïden die aanwezig zijn in ruwe en gezuiverde polyfenol-extracten van BL ( tabel 1 ). CE was verrijkt in gallinezuur, ferulzuur, 4-0-caffeoylchinezuur en 5-0-caffeoylchinezuur. Het zuiveringsproces heeft de niveaus van gallinezuur en p-coumaarzuur niet significant veranderd. Het verhoogde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de American Heart Association (14GRNT20180028) en de Florida State University Council for Research and Creativity (COFRS).
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
- Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions–a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
- Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
- Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
- Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
- Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity?. Crit Rev Food Sci Nutr. 56, S46-S59 (2016).
- Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
- Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
- Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
- Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
- Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
- Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
- Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
- Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
- Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
- Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
- Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
- Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
- Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
- Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
- Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
- Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
- Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
- Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
- Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, 2.1-2.12 (2002).
- Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
- Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
- Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).
