Estrazione e purificazione di polifenoli da polvere di bacche congelata per il trattamento di cellule muscolari lisce vascolari<em> In vitro</em
Summary
Questo lavoro descrive un metodo passo-passo per preparare estratti ricchi di polifenoli dalla polvere di bacche congelata. Inoltre, fornisce una descrizione approfondita di come utilizzare questi estratti ricchi di polifenoli nella coltura cellulare in presenza dell'ormone peptidico angiotensino II (Ang II) utilizzando cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs).
Abstract
Gli studi epidemiologici indicano che l'aumento dell'assunzione di flavonoidi è correlato alla diminuzione della mortalità dovuta a malattie cardiovascolari (CVD) negli Stati Uniti (Stati Uniti) e in Europa. Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno un elevato contenuto polifenolico. I polifenoli hanno dimostrato di interagire con molti obiettivi molecolari e di esercitare numerose funzioni biologiche positive, inclusi gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e cardioprotettivi. I polifenoli isolati dalla mora (BL), dal lampone (RB) e dal lampone nero (BRB) riducono lo stress ossidativo e la senescenza cellulare in risposta all'angiotensina II (Ang II). Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata del protocollo utilizzato per preparare gli estratti di polifenoli da bacche congelate. Le estrazioni di polifenoli dalla polvere di bacche congelata sono state eseguite utilizzando l'etanolo acquoso al 80% ed un metodo di estrazione ad ultrasuoni. L'estratto grezzo è stato ulteriormente purificato e frazionato utilizzando cloroformio e acetato di etile,rispettivamente. Gli effetti di entrambi gli estratti grezzi e purificati sono stati testati su cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) in coltura.
Introduction
I polifenoli sono composti che contengono almeno un anello fenolico nella loro struttura e sono abbondantemente presenti nel regno vegetale 1 . Gli esseri umani hanno consumato piante per millenni per scopi medicinali senza essere consapevoli dell'esistenza di tali composti 2 . Molti frutti e verdure hanno alcuni composti polifenolici condivisi, anche se con quantità diverse, tra cui flavonoidi, stilbene e acidi fenolici 3 . Anche se i polifenoli sono spesso associati a frutta e verdura colorati, questo non è strettamente vero. Ad esempio, zeaxantina e xantina sono presenti nelle verdure che non sono molto colorate, come le cipolle e l'aglio, provenienti dalla famiglia di scalloni e sono associati a numerosi benefici per la salute 4 . Oltre ad essere associati a numerosi vantaggi sanitari 5 , i polifenoli servono anche le piante proteggendole dagli insettiD radiazione ultravioletta 2 . I polifenoli si trovano comunemente nella dieta umana e sono considerati potenti antiossidanti, in quanto possono scavare le specie reattive di ossigeno (ROS) 6 , 7 , 8 . Hanno anche antinfiammatori 9 , antimicrobici 10 , antipertensivi 11 e 12 , 13 proprietà anti-cancerogene.
Gli studi epidemiologici dimostrano un'associazione inversa tra il consumo di flavonoidi e la malattia cardiovascolare (CVD) 16 , 17 e la mortalità 14 , 15 . Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno elevate quantità di polifenoli, compresi i flavonoidi. Ad esempio, il consumo di succo di mora (BL) (300 Ml / d) per otto settimane ha significativamente ridotto la pressione sistolica nei pazienti dislipidemici 18 . Jeong et al. 19 riportarono che gli uomini e le donne pre-ipertensivi che consumavano 2,5 g di estratto di lampone nero (BRB) al giorno avevano una pressione arteriosa più bassa di 24 ore e di notte rispetto a quelle che consumavano un placebo. Raspberries (RB) ha ridotto la pressione sanguigna mentre aumenta l'espressione di superossido dismutasi (SOD) in ratti spontaneamente ipertensivi 20 . Recentemente è stato dimostrato che BL, RB e BRB riducono i livelli di ROS e senescenza indotti da angiotensina II (Ang II) in cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) 21 . Inoltre, la frazione di antocianina dall'estratto BL ha ridotto l'espressione di sintesi dell'ossido nitrico induttivo (iNOS) e ha inibito l'attività del fattore nucleare kappa B (NF-κB) e della chinasi extracellulare-regolata (ERK) nel lipopolisaccaride (LPS) stimolata J774 celluleAss = "xref"> 22. Gli estratti BRB hanno ridotto l'attivazione di NF-κB e l'espressione cicloossigenasi 2 (COX-2) in vitro 23 , ha migliorato il profilo lipidico e ha impedito la formazione di lesioni aterosclerosi nei topi alimentati ad una dieta ad alto contenuto di grassi 24 . Le antocianine, considerate i flavonoidi più abbondanti nelle bacche, modulano la risposta infiammatoria nei macrofagi RAW 264.7 stimolati da LPS diminuendo la produzione di alfa TNF-α 25 e diminuendo la proliferazione e la migrazione di VSMCs 26 .
Dal momento che è cresciuto interesse a capire il ruolo dei polifenoli nella salute umana e nelle malattie, è importante ottimizzare il metodo di estrazione. L'estrazione del solvente è ampiamente utilizzata per questo scopo, in quanto è conveniente e facilmente riproducibile. In questo studio, è stata utilizzata un'estrazione di solvente con l'etanolo, insieme ad un estratto ad ultrasuoniN, che è stato adattato da Kim e Lee 27 . La purificazione e la frazionamento di estratti grezzi (CE) utilizzando cloroformio e acetato di etile sono state eseguite per ottenere la frazione di estratto purificato (PE) che è stato adattato da Queires et al 28 . Inoltre, sono stati confrontati l'efficacia degli estratti di polifenoli grezzi e purificati da BL alla riduzione della fosforilazione basale di ERK1 / 2 e sono stati forniti esempi rappresentativi dell'effetto inibitorio dell'estratto policifenolo BL purificato sulle riduzioni di segnalazione induciate da Ang II in VSMCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
I polifenoli isolati dalle bacche contengono composizioni distinte. Il protocollo di estrazione a base di etanolo qui descritto ha permesso di identificare diversi livelli di acidi fenolici e flavonoidi presenti nei grezzi e purificati estratti polifenolici di BL ( Tabella 1 ). CE è stata arricchita in acido gallico, acido ferulico, acido 4-O-caffeoilchinico e acido 5-O-caffeoilchinico. Il processo di purificazione non alterava significativamente i livelli di acido gallico e acido p-cumarico. Tuttavia,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dall'American Heart Association (14GRNT20180028) e dal Florida State University Council sulla ricerca e la creatività (COFRS).
Materials
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| FBS | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
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