تعبير البروتين المؤتلف، التبلور، والدراسات البيوفيزيائية ل<em> العصوية</em> -conserved النيوكليوتيد بيروفوسفوريلاس، بكمازغ
Summary
عصيات الجمرة الخبيثة هو الممرض الملزم من الجمرة الخبيثة استنشاق قاتلة، لذلك يتم تنظيم دراسات جيناته والبروتينات بدقة. وثمة نهج بديل هو دراسة الجينات أورثولوغوس. نحن تصف الدراسات الفيزيائية الحيوية من B. انثراسيس أورثولوغ في B. سيريوس ، bc1531، التي تتطلب الحد الأدنى من المعدات التجريبية والافتقار إلى مخاوف تتعلق بالسلامة خطيرة.
Abstract
للتغلب على القيود واللوائح السلامة عند دراسة الجينات والبروتينات من مسببات الأمراض الحقيقية، ويمكن دراسة مثيلاتها. عصيات الجمرة الخبيثة هو الممرض الملزم الذي يسبب الجمرة الخبيثة استنشاق قاتلة. عصية سيريوس يعتبر نموذجا مفيدا لدراسة B. الجمرة الخبيثة بسبب العلاقة التطورية وثيقة. يتم حفظ مجموعة الجينات ba1554 – ba1558 من B. الجمرة الخبيثة للغاية مع الكتلة bc1531 – bc1535 في B. سيريوس ، وكذلك مع الكتلة bt1364-bt1368 في عصيات ثورينجينزيس، مما يدل على الدور الحاسم للجينات المرتبطة في جنس عصيات . تصف هذه المخطوطة طرق إعداد وتوصيف منتج بروتين من الجين الأول ( ba1554 ) من مجموعة الجينات في B. انثراسيس باستخدام بروتين المؤتلف من أورثولوغ في B. سيريوس ، bc1531.
Introduction
يستخدم تعبير البروتين المؤتلف على نطاق واسع للتغلب على المشاكل المرتبطة بمصادر البروتين الطبيعية، مثل كميات البروتين محدودة والتلوث الضارة. وعلاوة على ذلك، في دراسات الجينات المسببة للأمراض والبروتينات، سلالة المختبرات البديلة التي لا تتطلب احتياطات السلامة إضافية يمكن استخدامها. على سبيل المثال، عصية سيريوس هو نموذج مفيد لدراسة عصيات الجمرة الخبيثة بسبب العلاقة التطورية وثيقة 1 .
B. الجمرة الخبيثة هو الممرض الملزم الذي يسبب الجمرة الخبيثة استنشاق قاتلة في البشر والماشية، ويمكن أن تستخدم كطائرة بيولوجية 2 . وهكذا، فإن الدراسات المختبرية على B. الخبيثة تخضع لرقابة صارمة من قبل المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض، والتي تتطلب ممارسات السلامة البيولوجية المستوى 3 (بسل-3)، التي تنص على فصل منطقة المختبر مع ضغط الغرفة السلبي. على النقيض من B. الجمرة الخبيثة </eم>، يتم تصنيف B. سيريوس كعامل بسل-1 وبالتالي لديه الحد الأدنى من المخاوف المتعلقة بالسلامة. B. سيريوس هو الممرض الانتهازية التي، عند الإصابة، يسبب التسمم الغذائي التي يمكن علاجها دون مساعدة طبية. ومع ذلك، لأن B. سيريوس سهم العديد من الجينات الحرجة مع B. الجمرة الخبيثة ، وظائف B. البروتينات الجمرة الخبيثة يمكن دراستها باستخدام هومولوجس المقابلة من B. سيريوس 1 .
يتم حفظ ba1554 – ba1558 مجموعة الجينات من B. الجمرة الخبيثة للغاية مع bc1531 – bc1535 العنقودية من B. سيريوس ، وكذلك مع مجموعة bt1364-bt1368 من عصيات ثورينجينزيس ، من حيث تنظيم الجينات وتسلسل. وعلاوة على ذلك، فإن الجينات الأولى ( ba1554 ، bc1531 ، و bt1364 ) من مجموعات كل الحفاظ عليها تماما ( أي 100٪ هوية تسلسل النوكليوتيدات)، إمبلينانوغرام دورا حاسما للمنتج الجين في الأنواع العصوية . نظرا لموقعها في هذه المجموعات الجينية، تم تعريف ba1554 خطأ كمنظم النسخ المفترضة 3 . ومع ذلك، تحليل تسلسل الأحماض الأمينية من المنتج ba1554 يشير إلى أنه ينتمي إلى عائلة مازغ، التي لديها نشاط النيوكليوتيدات بيروفوسفهيدرولاز ولا يرتبط مع نشاط عامل النسخ 4 ، 5 . على الرغم من أن البروتينات التي تنتمي إلى عائلة مازغ متنوعة فيما يتعلق بالتتابع الكلي والطول، فإنها تشترك في نطاق مازغ 100 ~ متبقي يتميز عزر إكس 12-28 إكسد ("X" يقف على أي بقايا حمض أميني، وعدد يشير إلى عدد من بقايا X).
مجال مازغ لا دائما تمثل مباشرة لنشاط حفزي معين. عضو مازغ من الإشريكية القولونية (إكمازغ) تمتلك اثنين من المجالات مازغ، ولكن جرالي C- محطة مازغ المجال هو الأنزيمية نشطة 6 . وعلاوة على ذلك، فإن خصوصية الركيزة من إنزيمات مازغ يختلف من ثلاثي فوسفات النيوكليوسيد غير محددة (ل إكمازغ) إلى دكب / داتب محددة (للمازجين المرتبطة إنتغرين) و دوتب (ل دوتباسيس) 6 ، 7 ، 8 ، 9 . ولذلك، والتحليلات الفيزيائية الحيوية للبروتين BA1554 ضرورية لتأكيد نشاطها نتباز وفك خصوصية ركيزة لها.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة أن معظم المختبرات دون مرفق بسل-3 يمكن أن يتبع لتوصيف المنتج البروتين من الجين B. سيريوس bc1531 ، وهو أورثولوغ من B. انثراسيس ba1554 ، على المستوى الجزيئي. باختصار، تم التعبير عن BC1531 المؤتلف (rBC1531) في E. القولونية وتنقيتها باستخدام علامة تقارب. للتجارب البلورية بالأشعة السينية، البلوريةتم فحص ظروف زاتيون من البروتين RBC1531 والأمثل. لتقييم النشاط الأنزيمي من RBC1531، تم رصد نشاط نتباز كولوريمتريكالي لتجنب نوكلأوتيدس المسمى إشعاعيا التي تم استخدامها تقليديا. وأخيرا، مكننا تحليل البيانات الفيزيائية الحيوية التي تم الحصول عليها من تحديد حالة أوليغوميريزاتيون والمعلمات الحفازة من rBC1531، وكذلك للحصول على بيانات حيود الأشعة السينية من الكريستال rc1531.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
جمعت مجموعات بيانات حيود الأشعة السينية في خط الأشعة 7A لمختبر مسرع بوهانغ (كوريا). وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج بحوث العلوم الأساسية التي تديرها المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (نرف)، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (2015R1A1A01057574 إلى م).
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
References
- Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
- Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
- Deli, A., et al. LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis. FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).
- Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. MazG — a regulator of programmed cell death in Escherichia coli. Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).
- Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. House cleaning, a part of good housekeeping. Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).
- Lee, S., et al. Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response. J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).
- Moroz, O. V., et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential "house-cleaning" functions. J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).
- Robinson, A., et al. A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype. Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).
- Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, (2012).
- Brown, T. A. . Gene cloning an introduction. , (1986).
- Kim, M. I., Hong, M. Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase. Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).
- Sheehan, D. . Physical biochemistry: Principles and applications. , (2009).
- Lesley, S. A., Wilson, I. A. Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics. J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).
- Jeon, Y. J., et al. Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase. J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).
