重组蛋白表达，结晶和生物物理研究<em>芽孢杆菌</em> - 保守的核苷酸焦磷酸化酶，BcMazG
Summary
炭疽芽孢杆菌是致命性吸入性炭疽的专性病原体，因此对其基因和蛋白质的研究受到严格管制。另一种方法是研究直系同源基因。我们描述了蜡状芽孢杆菌Bc1531中的炭疽杆菌直系同源物的生物物理化学研究，需要最少的实验设备和缺乏严重的安全性问题。
Abstract
为了克服从真菌病原体研究基因和蛋白质时的安全限制和规定，可以研究其同源物。 炭疽芽孢杆菌是引起致命性吸入性炭疽的专性病原体。 蜡状芽孢杆菌被认为是研究炭疽杆菌由于其进化关系密切的有用模型。 炭疽杆菌的基因簇ba1554 -ba1558与枯草芽孢杆菌中的bc1531-bc1535簇以及苏云金芽孢杆菌中的bt1364-bt1368簇具有高度保守性，表明了相关基因在芽孢杆菌属中的关键作用。该手稿描述了使用其在蜡样 芽孢杆菌bc1531中其直向同源物的重组蛋白质来制备和表征来自炭疽杆菌的基因簇的第一基因（ ba1554 ）的蛋白质产物的方法。
Introduction
重组蛋白表达被广泛用于克服与天然蛋白质来源有关的问题，如有限的蛋白质量和有害的污染。此外，在致病基因和蛋白质的研究中，可以使用不需要额外的安全预防措施的替代实验室菌株。例如， 蜡状芽孢杆菌是研究炭疽芽孢杆菌的有用模型，由于它们的进化关系密切。
B.炭疽病是一种专门的病原体，在人类和家畜中引起致命的吸入性炭疽病，可能被用作生物武器2 。因此，炭疽杆菌的实验室研究受到美国疾病控制中心的严格监管，要求生物安全3级（BSL-3）的做法，要求实验室区域以负压力隔离。与炭疽杆菌相反 </em 。，蜡状芽孢杆菌被分类为BSL-1代理，因此具有最小的安全性问题。 蜡状芽孢杆菌是一种机会性病原体，在感染后会导致食物中毒，可以在没有医疗帮助的情况下治疗。然而，由于蜡状 芽孢杆菌与炭疽杆菌共享许多关键基因，可以使用蜡样芽孢杆菌 1的相应同系物研究炭疽杆菌蛋白质的功能。
炭疽杆菌的ba1554 – ba1558基因簇与bc1531 – bc1535簇高度保守 的蜡状 芽孢杆菌 ，以及苏云金芽孢杆菌的bt1364-bt1368簇，在基因组织和序列方面。此外，各簇的第一个基因（ ba1554 ， bc1531和bt1364 ）是绝对保守的（ 即 100％核苷酸序列同一性），暗示在芽孢杆菌属中引起基因产物的关键作用。由于其在这些基因簇中的位置， ba1554被误认为是推定的转录调节因子3 。然而， ba1554产品的氨基酸序列分析表明它属于MazG家族，其具有核苷酸的焦磷酸水解酶活性，与转录因子活性无关4,5 。虽然属于MazG家族的蛋白质在总体序列和长度上是不同的，但它们共有一个共同的〜100个残基的MazG结构域，其特征在于EXXE 12-28 EXXD基序（“X”代表任何氨基酸残基，表示X残基数）。
MazG域并不总是直接涉及某种催化活性。来自大肠杆菌 （EcMazG）的MazG成员具有两个MazG结构域，但是C末端MazG结构域具有酶活性6 。此外，MazG酶的底物特异性从非特异性核苷三磷酸（对于EcMazG）到特异性dCTP / dATP（用于整联蛋白相关MazG）和dUTP（对于dUTP酶） 6,7,8,9不同 。因此，BA1554蛋白的生物物理化学分析是确定其NTPase活性和破译其底物特异性所必需的。
在这里，我们提供了一个分步骤方案，大多数没有BSL-3设施的实验室可以跟踪分子水平上表现为蜡状芽孢杆菌b1515基因的蛋白质产物，这是B. anthracis ba1554的直系同源物。简言之，重组BC1531（rBC1531）在大肠杆菌中表达 ，并使用亲和标签纯化。对于X射线晶体学实验，结晶筛选和优化rBC1531蛋白的定位条件。为了评估rBC1531的酶活性，以比色法监测NTPase活性，以避免常规使用的放射性标记的核苷酸。最后，对获得的生物物理化学数据的分析使我们能够确定rBC1531的低聚状态和催化参数，以及从rBC1531晶体获得X射线衍射数据。
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在浦项加速器实验室（韩国）的束线7A处收集X射线衍射数据。这项研究得到了由科学，ICT和未来规划部（2015R1A1A01057574至MH）资助的由韩国国家研究基金会（NRF）管理的基础科学研究计划的支持。
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
References
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