Expresión de Proteínas Recombinantes, Cristalización y Estudios Biofísicos de un<em> Bacillus</em> -conservado Nucleótido Pirofosforilasa, BcMazG
Summary
Bacillus anthracis es el patógeno obligado del ántrax por inhalación fatal, por lo que los estudios de sus genes y proteínas están estrictamente regulados. Un enfoque alternativo es estudiar los genes ortólogos. Se describen los estudios biofísicoquímicos de un B. orthracis ortholog en B. cereus , bc1531, que requiere un mínimo de equipo experimental y la falta de graves preocupaciones de seguridad.
Abstract
Para superar las restricciones de seguridad y las regulaciones al estudiar genes y proteínas de patógenos verdaderos, sus homólogos pueden ser estudiados. Bacillus anthracis es un patógeno obligado que causa el ántrax mortal por inhalación. Bacillus cereus es considerado un modelo útil para estudiar B. anthracis debido a su estrecha relación evolutiva. El grupo de genes ba1554 – ba1558 de B. anthracis está altamente conservado con el grupo bc1531 – bc1535 en B. cereus , así como con el grupo bt1364 – bt1368 en Bacillus thuringiensis, lo que indica el papel crítico de los genes asociados en el género Bacillus . Este manuscrito describe métodos para preparar y caracterizar un producto proteico del primer gen ( ba1554 ) del grupo genético en B. anthracis usando una proteína recombinante de su ortholog en B. cereus , bc1531.
Introduction
La expresión de proteínas recombinantes se utiliza ampliamente para superar problemas asociados con fuentes de proteínas naturales, tales como cantidades limitadas de proteínas y contaminación perjudicial. Además, en estudios de genes y proteínas patógenos, se puede utilizar una cepa alternativa de laboratorio que no requiere precauciones de seguridad adicionales. Por ejemplo, Bacillus cereus es un modelo útil para estudiar Bacillus anthracis debido a su estrecha relación evolutiva 1 .
B. anthracis es un patógeno obligado que causa el ántrax mortal por inhalación en humanos y ganado y potencialmente puede ser utilizado como bioweapon 2 . Por lo tanto, los estudios de laboratorio sobre B. anthracis están estrictamente regulados por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos, que requieren prácticas de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) que obligan a separar el área del laboratorio con presión negativa. En contraste con B. anthracis </eM>, B. cereus se clasifica como un agente BSL-1 y por lo tanto tiene preocupaciones mínimas de seguridad. B. cereus es un patógeno oportunista que, tras la infección, causa intoxicación alimentaria que puede ser tratada sin asistencia médica. Sin embargo, debido a que B. cereus comparte muchos genes críticos con B. anthracis , las funciones de las proteínas de B. anthracis se pueden estudiar usando los correspondientes homólogos de B. cereus 1 .
El grupo de genes ba1554 – ba1558 de B. anthracis se conserva altamente con el grupo bc1531 – bc1535 De B. cereus , así como con el grupo bt1364-bt1368 de Bacillus thuringiensis , en términos de organización de genes y secuencia. Además, los primeros genes ( ba1554 , bc1531 y bt1364 ) de los respectivos grupos están absolutamente conservados ( es decir, 100% de identidad de secuencia de nucleótidos), implyiNg un papel crítico del producto génico en las especies de Bacillus . Debido a su ubicación en estos grupos de genes, ba1554 fue mal identificado como un regulador de transcripción putativo [ 3] . Sin embargo, el análisis de la secuencia de aminoácidos del producto ba1554 indica que pertenece a la familia MazG, que tiene actividad de nucleótido pirofosfohidrolasa y no está asociada con la actividad del factor de transcripción 4 , 5 . Aunque las proteínas pertenecientes a la familia MazG son diversas con respecto a la secuencia y longitud totales, comparten un dominio MazG común de ~ 100-residuo caracterizado por un motivo EXXE 12-28 EXXD ("X" representa cualquier residuo de aminoácido, y el número Indica el número de residuos X).
El dominio MazG no siempre explica directamente una cierta actividad catalítica. Un miembro MazG de Escherichia coli (EcMazG) posee dos dominios MazG, pero enLy el dominio C-terminal MazG es enzimáticamente activo [ 6] . Por otra parte, la especificidad del sustrato de las enzimas MazG varía de nucleoside trifosfatos no específicos (para EcMazG) a dCTP / dATP específicos (para integrinas asociadas a MazG) y dUTP (para dUTPases) 6 , 7 , 8 , 9 . Por lo tanto, los análisis biofísicoquímicos de la proteína BA1554 son necesarios para confirmar su actividad NTPasa y para descifrar su especificidad de sustrato.
En este sentido, proporcionamos un protocolo paso a paso que la mayoría de los laboratorios sin un BSL-3 puede seguir para caracterizar el producto proteico del gen B. cereus bc1531 , que es un ortólogo de B. anthracis ba1554 , a nivel molecular. Brevemente, el BC1531 recombinante (rBC1531) se expresó en E. coli y se purificó usando una etiqueta de afinidad. Para los experimentos cristalográficos de rayos X,Zación de la proteína rBC1531 se seleccionaron y optimizaron. Para evaluar la actividad enzimática de rBC1531, la actividad de NTPasa se monitorizó colorimétricamente para evitar nucleótidos radiactivamente marcados que se han usado convencionalmente. Finalmente, los análisis de los datos biofísicoquímicos obtenidos nos permitieron determinar el estado de oligomerización y los parámetros catalíticos de rBC1531, así como obtener datos de difracción de rayos X del cristal rBC1531.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los conjuntos de datos de difracción de rayos X se recogieron en la línea de haz 7A del Laboratorio de Aceleración de Pohang (Corea). Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación Científica Básica administrado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación del Futuro (2015R1A1A01057574 a MH).
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
References
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