Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

Os receptores G-Protein-Coupled (GPCRs) são uma grande família de receptores de superfície celular responsáveis ​​por uma série notável de processos fisiológicos, incluindo analgesia, olfação e comportamento ¹ . Os GPCRs atuam detectando sinais externos específicos e subsequentemente estimulando a sinalização intracelular. Eles, portanto, marcam uma junção de chave entre os ambientes externos e internos de uma célula. Devido ao papel crítico que os GPCRs desempenham na biologia, eles se tornaram os principais alvos tanto da pesquisa básica como da descoberta de drogas ^{2 , 3} .

Ao contrário de outras famílias de receptores que se ligam a ligandos discretos, os GPCRs podem ligar tipos diferentes de moléculas. Enquanto um GPCR pode interagir com péptidos, outro pode sentir fótons, pequenas moléculas ou íons ^{1 , 4} . Enquanto seus ligandos são diversos, os GPCRs são unificados em seu arquiteto geralUre e função. GPCRs individuais são constituídos por sete proteínas transmembranares α-helicoidais com terminais amino extracelulares e terminais carboxílicos intracelulares ^{5 , 6} . Os GPCRs são acoplados a proteínas intracelulares – complexos de proteínas heterotriméricas compostos por subunidades α, β e γ – que medeiam diversas vias de sinalização ⁷ . A subunidade G _α é uma proteína de ligação a nucleótidos de guanina que é inativa quando vinculada ao difosfato de guanosina (PIB) e ativa quando vinculada ao trifosfato de guanosina (GTP) ^{8 , 9} . Quando os GPCRs ligam seus ligandos, eles sofrem uma mudança conformacional que permite que G _α se dissocie de G _βγ , _permitindo que G _α troque PIB por GTP ⁷ . O próprio receptor é fosforilado no seu terminal carboxílico por várias serina / tremonIne quinases ^{10 , 11} e internalizadas para atenuar a sinalização do receptor ^{12 , 13 , 14} . Enquanto isso, o monómero G _{α ativado e o} dímero G _βγ passam a ativar vias de sinalização distintas ⁷ . Existem várias isoformas de cada subunidade de proteína G, e cada isoforma tem como alvo vias a jusante particulares e sistemas de mensageiro secundário. As _principais isoformas de G _α incluem G _s , G _q , G _{i / o} e G _12-13 . Normalmente, os GPCR individuais se associam a uma isoforma particular de G _α , ligando assim um estímulo externo a uma resposta celular específica ¹ .

A caracterização de uma interação GPCR-ligando é fundamental para a compreensão da biologia do receptor. Como a troca GDP / GTP é uma das primeiras vésperasO que segue a ligação do ligando, o monitoramento da ligação GTP pode medir a ativação ou a inibição do GPCR. O ensaio de eventos mais a jusante na sinalização de GPCR geralmente não é quantitativo ou estequiométrico, pode não distinguir os agonistas completos de parciais e pode exigir reagentes caros. Além disso, o aumento da ligação GTP às proteínas G _α é um evento quase universal após a ativação do GPCR, o que significa que a medição da ligação GTP é um ensaio amplamente aplicável para o monitoramento da atividade da maioria dos GPCRs. Medir a ligação GTP é uma abordagem simples e rápida para monitorar a sinalização GPCR em células que sobreexpressam o receptor de interesse ou no tecido nativo. O presente protocolo detalha um ensaio funcional de ligação de GTP usando um GPCR arquetípico, o receptor de opióides μ (MOR1), para determinar quantitativamente a atividade de um agonista e antagonista na sinalização GPCR.

Este protocolo descreve primeiro como isolar as membranas brutas das células que sobre-expressam o MOR1. Observe queEste protocolo não se limita aos sistemas de sobreexpressão e pode ser aplicado a muitas fontes de membrana, incluindo tecido nativo ou preparações que expressam múltiplos receptores e proteínas G ¹⁵ . O protocolo então detalha como medir a ligação de um análogo GTP radioativo a essas membranas em resposta a concentrações variáveis ​​de [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) ou naloxone, um agonista e antagonista MOR1, respectivamente. O análogo GTP, [35S] guanosina-5'-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPγS) não é hidrolisável. Esta propriedade é crítica porque as subunidades de G _α exibem atividade de GTPase intrínseca ⁷ e eliminariam o fosfato de gama marcado em um radioquímico GTP hidrolisável. As membranas são então presas em filtros de fibra de vidro e lavadas, após o que a GTP radiomarcada é quantificada por contagem de cintilação líquida. Múltiplos parâmetros farmacológicos podem ser derivados para caracterizarE a interação receptor-ligando, incluindo a resposta semi-máxima (EC ₅₀ ) e coeficiente de Hill (n _H ) para agonistas e a concentração inibidora semi-máxima (IC50) e constante de dissociação de equilíbrio (Kb) para antagonistas ^{16 , 17 , 18} .