Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding
Summary
Guanosine trifosfaat (GTP) binding is een van de vroegste gebeurtenissen bij G-proteïne-koppelde receptor (GPCR) activatie. Dit protocol beschrijft hoe u specifieke GPCR-ligandinteracties farmacologisch kunt karakteriseren door de binding van het radioactief gemerkte GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) te monitoren in Reactie op een ligand van interesse.
Abstract
G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn een grote familie van transmembrane receptoren die kritische rollen spelen in normale cellulaire fysiologie en vormen een belangrijk farmacologisch doel voor meerdere indicaties, waaronder analgesie, bloeddrukregulatie en de behandeling van psychiatrische aandoeningen. Bij ligandbinding katalyseren GPCR's de activatie van intracellulaire G-eiwitten door de incorporation van guanosinetrifosfaat (GTP) te stimuleren. Geactiveerde G-eiwitten stimuleren dan signaleringspaden die cellulaire reacties opwekken. GPCR-signalering kan worden gecontroleerd door de opneming van een radioactief gemerkte en niet-hydrolyseerbare vorm van GTP, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) in G-eiwitten te meten. In tegenstelling tot andere methoden die meer stroomafwaartse signaleringsprocessen beoordelen, meet [35S] GTPγS-binding een proximale gebeurtenis bij GPCR-signalering en, belangrijker, kan agonis onderscheidenTs, antagonisten en inverse agonisten. Het onderhavige protocol schetst een gevoelige en specifieke werkwijze voor het bestuderen van GPCR-signalen met behulp van ruwe membraanpreparaten van een archetypische GPCR, de μ-opioïde receptor (MOR1). Alhoewel er alternatieve benaderingen zijn voor het fractioneren van cellen en weefsels, zijn er veel kostenverbod, vervelend en / of niet-standaard laboratoriumapparatuur. De huidige methode verschaft een eenvoudige procedure die functionele ruwe membranen verrijkt. Na het isoleren van MOR1 werden verschillende farmacologische eigenschappen van zijn agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefaline (DAMGO) en antagonist, naloxon, bepaald.
Introduction
G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn een grote familie van celoppervlakreceptoren die verantwoordelijk zijn voor een opmerkelijke reeks fysiologische processen, waaronder analgesie, olfaction en gedrag 1 . GPCRs handelen door specifieke externe signalen te detecteren en vervolgens intracellulaire signalering te stimuleren. Ze markeren daarom een belangrijke koppeling tussen de externe en interne omgevingen van een cel. Vanwege de cruciale rol die GPCR's spelen in de biologie, zijn ze belangrijke doelen geworden voor zowel basisonderzoek en drugsontdekking 2 , 3 .
In tegenstelling tot andere receptorfamilies die discrete liganden binden, kunnen GPCR's heel verschillende soorten moleculen binden. Terwijl een GPCR met peptiden kan interageren, kan een andere fotonen, kleine moleculen of ionen 1 , 4 aanvoelen. Terwijl hun liganden divers zijn, zijn GPCR's verenigd in hun algemene architectUre en functie. Individuele GPCR's bestaan uit zeven α-helische transmembraaneiwitten met extracellulaire aminoterminalen en intracellulaire carboxylterminals 5 , 6 . GPCR's zijn gekoppeld aan intracellulaire G-eiwitten-heterotrimerische eiwitcomplexen die zijn samengesteld uit a-, p- en y-subunits-die diverse signaalwegen 7 bemiddelen. De G a -subeenheid is een guanine nucleotide-bindend eiwit dat inactief is wanneer gebonden aan guanosinedifosfaat (BBP) en actief wanneer gebonden aan guanosinetrifosfaat (GTP) 8 , 9 . Wanneer GPCR's hun liganden binden, ondergaan ze een conformatieverandering die G a toelaat zich te scheiden van G γ , waardoor G α het BBP voor GTP 7 kan uitwisselen . De receptor zelf wordt gefosforyleerd bij zijn carboxylterminal door verschillende serine / threonIne kinasen 10 , 11 en geïnternaliseerd om de receptorsignalen 12 , 13 , 14 te verzwakken. Ondertussen gaan het geactiveerde G a monomeer en G β dimeer voort om afzonderlijke signaleringswegen 7 te activeren. Er zijn verschillende isoformen van elke G-eiwit subeenheid, en elke isoform is gericht op specifieke stroomafwaartse en secundaire messenger systemen. De grote G a isoformen omvatten G s , G q , G i / o en G 12-13 . Typisch associëren individuele GPCR's met een bepaalde G a- isoform, waardoor een externe stimulus gekoppeld wordt aan een specifieke cellulaire respons 1 .
Het karakteriseren van een GPCR-ligand interactie is cruciaal voor het begrijpen van de biologie van de receptor. Aangezien de BBP / GTP-uitwisseling een van de vroegste vooravond isNts die volgend bindend bindend zijn, het monitoren van GTP-binding kan GPCR-activering of remming meten. Het analyseren van meer stroomafwaartse gebeurtenissen bij GPCR-signalering is vaak niet zo kwantitatief of stoichiometrisch, kan geen volledige agonisten van partiële groepen onderscheiden en kunnen dure reagentia vereisen. Bovendien, verhoogde GTP binding aan G α eiwitten is een bijna universele gebeurtenis na GPCR activatie, wat betekent dat meten van GTP binding een breed toepasselijke analyse is voor het monitoren van de activiteit van de meeste GPCR's. Het meten van GTP-binding is een eenvoudige en snelle aanpak om GPCR-signalering in cellen te monitoren die de receptor van belang of in het natieve weefsel overexpressieert. Het onderhavige protocol beschrijft een functionele GTP-bindingsassay onder gebruikmaking van een archetypische GPCR, de μ-opioïde receptor (MOR1) om de activiteit van een agonist en antagonist op GPCR-signalering te bepalen.
Dit protocol beschrijft eerst hoe u ruwe membranen kan isoleren van cellen die MOR1 overexpresseren. OpmerkingDit protocol is niet beperkt tot overexpressiesystemen en kan toegepast worden op vele bronnen van membraan, met inbegrip van natief weefsel of preparaten die meerdere receptoren en G-eiwitten 15 uitdrukken. Het protocol beschrijft vervolgens hoe de binding van een radioactief GTP-analoog aan deze membranen wordt gemeten in reactie op verschillende concentraties van [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -kefalfine (DAMGO) of naloxon, een MOR1-agonist en antagonist, respectievelijk. Het GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) is niet hydrolyseerbaar. Deze eigenschap is kritisch omdat G a- subeenheden intrinsieke GTPase-activiteit 7 vertonen en het gemerkte gammafosfaat op een hydrolyseerbare GTP-radiochemische stof elimineren. Membraanen worden dan op glasvezelfilters gevangen en gewassen, waarna het radioactief gemerkt GTP gekwantificeerd wordt door middel van vloeibare scintillatietelling. Meerdere farmacologische parameters kunnen worden afgeleid naar karakterE de receptor-ligand interactie, inclusief de half maximale respons (EC 50 ) en Hill coëfficiënt (n H ) voor agonisten en de half maximale remmende concentratie (IC 50 ) en evenwichtsdissociatieconstante (Kb) voor antagonisten 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Het onderhavige protocol beschrijft twee afzonderlijke maar complementaire methoden: een eenvoudige aanpak van fractioneren cellen en weefsels in brede maar aparte compartimenten en een middel om GPCR signalering te onderzoeken door de meting van [ 35 S] GTPγS binding.
Efficiënte cellulaire fractionering heeft een breed scala aan toepassingen, variërend van de extractie en verrijking van eiwitten, naar de beoordeling van de subcellulaire lokalisatie van eiwitten, aan de studie …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health subsidie DA-000266 en het Medisch Wetenschappelijk Opleidingsprogramma T32-subsidie (CV, NWZ, en PCS). De auteurs willen ook somersault18: 24 (somersault1824.com) voor de Library of Science & Medical Illustrations erkennen.
Materials
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in 37°C water bath before use |
| Cell culture 10-cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| non-radiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5′-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin – Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5′-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- Sittampalam, G. S., et al. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
