Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

G-Protein Bağlı Reseptörler (GPCR), analjezi, koku alma ve davranış gibi dikkate değer bir dizi fizyolojik sürecin sorumlu olduğu hücre yüzeyi reseptörlerinden oluşan geniş bir ailedir. GPCR'ler spesifik harici sinyalleri algılayarak ve daha sonra hücre içi sinyallemeyi uyararak hareket eder. Bu nedenle, bir hücrenin dış ve iç ortamları arasında önemli bir kavşağa işaret ediyorlar. GPCR'lerin biyolojide oynadığı kritik rol nedeniyle ^, hem temel araştırmalar hem de ilaç keşfi ^{2 , 3} için önemli hedefler haline gelmiştir.

Ayrı ligandları bağlayan diğer reseptör ailelerinden farklı olarak, GPCRler çok farklı molekül tiplerini bağlayabilir. Bir GPCR peptitlerle etkileşime geçebilirken, bir diğeri fotonları, küçük molekülleri veya iyonları ^{1 , 4'ü} algılayabilir. Ligandları çeşitlidir, ancak GPCR'ler genel mimarında birleşirUre ve işlev. Bireysel GPCR'ler hücre dışı amino terminalleri ve hücre içi karboksil terminalleri ^{5 , 6} olan yedi adet α-sarmal transmembran proteinden oluşur. GPCR'ler, α, β ve γ alt birimlerinden oluşan heterotrimerik protein kompleksleri olan çeşitli sinyal yollarına aracılık eden hücre içi G proteinlerine bağlanırlar. G _α altbirimi, guanozin difosfata (GDP) bağlandığında inaktif olan ve guanozin trifosfata (GTP) ^{8 , 9} bağlı olduğunda aktif olan bir guanin nükleotid bağlayıcı proteindir. GPCR'ler ligandlarına bağlandığında, Gα'nın Gβγ'dan ayrılmasına ve böylece Gα'nın GTP ⁷ için GSYİH'nın değişimine izin verecek şekilde konformasyonel bir değişime uğrarlar. Reseptörün kendisi karboksil terminalinde çeşitli serin / threon tarafından fosforile edilmiştirIne kinazlar ^{10 , 11} ve reseptör sinyalini zayıflatmak için içselleştirilmiş ^{12 , 13 , 14} . Bu arada aktive edilmiş G _α monomeri ve G _βγ dimeri belirgin sinyal yollarını aktive eder ⁷ . Her bir G-protein alt biriminin birkaç izoformu vardır ve her izoform belirli aşağı yönlü yolları ve ikincil haberci sistemlerini hedeflemektedir. Büyük G _α izoformları, G _s , G _q , G _{i / o} ve G _{12-13'ü içerir} . Genellikle, bireysel GPCR'ler belirli bir G _α izoformuyla ilişkilendirilir, böylece bir dış uyaran belirli bir hücresel tepki ^1'e bağlanır.

Bir GPCR-ligand etkileşimini karakterize etmek, reseptörün biyolojisini anlamak için kritik önem taşır. GSYİH / GTP değişimi en erken arifelerden biri olduğu içinLigand bağlanmasını takip eden, GTP bağlanmasını izleyen nts GPCR aktivasyonunu veya inhibisyonunu ölçebilir. GPCR sinyallemesinde daha aşağı olayların tahlil edilmesi genellikle niceliksel ya da stokiometrik değildir, tam agonistleri kısmi olanlardan ayırt etmeyebilir ve pahalı reaktifler gerektirebilir. Dahası, Gα proteinlerine GTP bağlanmasının artması, GPCR aktivasyonunu takiben hemen hemen evrensel bir olaydır; bu, GTP bağlanmasının ölçülmesinin, çoğu GPCR'nin aktivitesini izlemek için genel olarak geçerli bir deney olduğu anlamına gelir. GTP bağlanmasının ölçülmesi, ilgi reseptörünü aşırı ifade eden hücrelerde veya doğal dokuda GPCR sinyallemesinin izlenmesi için basit ve hızlı bir yaklaşımdır. Bu protokol, bir archetypal GPCR, μ-opioid reseptörü (MOR1) kullanarak bir agonist ve antagonist aktivitesini kantitatif olarak GPCR sinyallemesi üzerinde saptamak için kullanılan fonksiyonel bir GTP bağlanma testini ayrıntılarıyla anlatmaktadır.

Bu protokol ilk önce ham membranların MOR1'i aşırı ifade eden hücrelerden nasıl izole edileceğini açıklar. Bunlara dikkat etBu protokol, aşırı sentezleme sistemleri ile sınırlı değildir ve doğal doku veya çoklu reseptörleri ve G proteinlerini ifade eden preparatlar da dahil olmak üzere, birçok membran kaynağına uygulanabilir ¹⁵ . Protokol daha sonra bir MOR1 agonisti ve antagonisti olan [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) veya naloksonun konsantrasyonlarına yanıt olarak bu zarlara bir radyoaktif GTP analoğunun bağlanmasının nasıl ölçüleceğini, sırasıyla. GTP analoğu [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPyS), hidrolize edilemez. Bu özellik kritiktir çünkü Gα altbirimleri intrinsik GTPaz aktivitesi ^{7 gösterir} ve hidrolize olabilen bir GTP radyokimyası üzerinde etiketli gama fosfatını ortadan kaldıracaktır. Membranlar daha sonra cam elyaf filtrelere bindirilir ve yıkanır, daha sonra radyoetiketlenmiş GTP sıvı sintilasyon sayımı ile nicelendirilir. Karakteristik olarak çoklu farmakolojik parametreler türetilebilirAntagonistler için agonistler için yarı maksimal tepki (EC ₅₀ ) ve tepe katsayısı (n _H ) ve yarı maksimum inhibisyon konsantrasyonu (IC50) ve denge ayrılma sabiti (Kb) de dahil olmak üzere reseptör-ligand etkileşimi ^{16 , 17 , 18} .