Mesure de la signalisation des récepteurs couplés à la protéine G via liaison GTP radiomarquée

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont une grande famille de récepteurs de surface cellulaire responsables d'une gamme remarquable de processus physiologiques, y compris l'analgésie, l'olfaction et le comportement ¹ . Les GPCR agissent en détectant des signaux externes spécifiques et en stimulant ensuite la signalisation intracellulaire. Ils marquent donc une jonction clé entre les environnements externe et interne d'une cellule. En raison du rôle critique que jouent les GPCR dans la biologie, ils sont devenus des cibles majeures pour la recherche fondamentale et la découverte de médicaments ^{2 , 3} .

Contrairement à d'autres familles de récepteurs qui se lient à des ligands discrets, les GPCR peuvent lier des molécules très différentes. Alors qu'un GPCR peut interagir avec des peptides, un autre peut détecter les photons, les petites molécules ou les ions ^{1 , 4} . Bien que leurs ligands soient diversifiés, les GPCR sont unifiés dans leur architecte généralUre et fonction. Les GPCR individuels sont constitués de sept protéines transmembranaires α-hélicoïdales avec des terminaux amino extracellulaires et des terminaux carboxyle intracellulaires ^{5 , 6} . Les GPCR sont couplés aux protéines G intracellulaires – complexes de protéines hétérotrimères composés de sous-unités α, β et γ – qui opèrent sur différentes voies de signalisation ⁷ . La sous-unité G _α est une protéine de liaison aux nucléotides de guanine qui est inactif lorsqu'elle est liée au diphosphate de guanosine (PIB) et active lorsqu'elle est liée au guanosine triphosphate (GTP) ^{8 , 9} . Lorsque les GPCR lient leurs ligands, ils subissent un changement conformationnel qui permet à G _{α de} se dissocier de G _βγ , permettant ainsi à G _α d'échanger le PIB pour GTP ⁷ . Le récepteur lui-même est phosphorylé à son extrémité carboxyle par divers serine / threonIne kinases ^{10 , 11} et internalisées pour atténuer la signalisation du récepteur ^{12 , 13 , 14} . Pendant ce temps, le monomère G _α activé et le dimère G _βγ procèdent à l'activation de voies de signalisation distinctes ⁷ . Il existe plusieurs isoformes de chaque sous-unité de protéine G, et chaque isoforme cible des voies en aval et des systèmes de messagerie secondaire particuliers. Les principales isoformes de G _α comprennent G _s , G _q , G _{i / o} et G _12-13 . Généralement, les GPCR individuels s'associaient à une isoforme G _α particulière, reliant ainsi un stimulus externe à une réponse cellulaire spécifique ¹ .

La caractérisation d'une interaction GPCR-ligand est essentielle pour comprendre la biologie du récepteur. Comme l'échange de PIB / GTP est l'une des premières veilleNts qui suit la liaison du ligand, la surveillance de la liaison GTP peut mesurer l'activation ou l'inhibition du GPCR. L'analyse de plus d'événements en aval dans la signalisation GPCR n'est souvent pas aussi quantitatif ni stoechiométrique, peut ne pas distinguer les agonistes complets de ceux partiels et peut nécessiter des réactifs coûteux. En outre, l'augmentation de la liaison GTP aux protéines G _α est un événement presque universel suite à l'activation du GPCR, ce qui signifie que la mesure de la liaison GTP est un dosage largement applicable pour le suivi de l'activité de la plupart des GPCR. La mesure de la liaison GTP est une approche simple et rapide pour surveiller la signalisation GPCR dans les cellules surexprimant le récepteur d'intérêt ou dans le tissu indigène. Le présent protocole détaille un dosage fonctionnel de liaison GTP en utilisant un GPCR archétypal, le récepteur μ-opioïde (MOR1), pour déterminer quantitativement l'activité d'un agoniste et d'un antagoniste sur la signalisation GPCR.

Ce protocole décrit d'abord comment isoler les membranes brutes des cellules qui surexpriment MOR1. Notez queCe protocole ne se limite pas aux systèmes de surexpression et peut être appliqué à de nombreuses sources de membrane, y compris des tissus indigènes ou des préparations exprimant des récepteurs multiples et des protéines G ¹⁵ . Le protocole détaille ensuite comment mesurer la liaison d'un analogue GTP radioactif à ces membranes en réponse à des concentrations variables de [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) ou de naloxone, un agoniste et antagoniste MOR1, respectivement. L'analogue GTP, [ ³⁵ S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ ³⁵ S] GTPγS) n'est pas hydrolysable. Cette propriété est critique parce que les sous-unités G _α présentent une activité GTPase intrinsèque ⁷ et élimineraient le phosphate gamma marqué sur un radiochimique GTP hydrolysable. Les membranes sont ensuite piégées sur des filtres à fibres de verre et lavées, après quoi le GTP radiomarqué est quantifié par comptage par scintillation liquide. Des paramètres pharmacologiques multiples peuvent être dérivés pour caractériserE l'interaction récepteur-ligand, y compris la réponse demi-maximale (EC ₅₀ ) et le coefficient Hill (n _H ) pour les agonistes et la concentration inhibitrice demi-maximale (IC ₅₀ ) et la constante de dissociation à l'équilibre (K _b ) pour les antagonistes ^{16 , 17 , 18} .