Экспрессия, очистка и антимикробная активность S100A12

Белки S100 представляют собой класс семейств кальцийсвязывающих белков семейства EF с разнообразным набором функций ¹ . Они экспрессируются тканевым и клеточно определенным образом и регулируют широкий спектр клеточных функций ^{2 , 3} . Уникальные для кальцийсвязывающих белков белки S100 обладают как внутриклеточными, так и внеклеточными функциями ^{4 , 5} . Внутри клетки связывание Ca ²⁺ вызывает конформационное изменение, которое обнажает гидрофобную поверхность, которая специфически нацелена на белок-связывающие партнеры ⁶ . Этот внутриклеточный механизм регулирует важные процессы, такие как клеточная пролиферация, дифференцировка и энергетический обмен. Во внеклеточной среде белки S100 проявляют две функции ⁷ . В одном они действуют как связанные с повреждением молекулярные структуры (DAMP) белки и инициируют провоспалительныеИммунный ответ через взаимодействие с рецепторами распознавания образов ^{8 , 9} . Кроме того, некоторые члены S100 белкового класса секвестрируют переходные металлы, функцию, которая служит для голодания микробных патогенов в процессе, называемом питательным иммунитетом ^10,11 .

S100A12 (также известный как кальгрунулин C и EN-RAGE) высоко экспрессируется в макрофагах и нейтрофилах и идентифицирован как потенциальный биомаркер воспалительных заболеваний ^{12 , 13} . В дополнение к связыванию кальция в его участках EF-Hand, S100A12 имеет два сайта связывания с высоким сродством переходного металла, расположенные на противоположных концах интерфейса ^{14 , 15} димера. Каждый сайт связывания состоит из трех остатков гистидина и одного остатка аспарагиновой кислоты и может содержать хелат цинка или меди <Sup class = "xref"> 16 ^{, 17} . Недавно мы сообщили, что S100A12-зависимое голодание от цинка играет важную роль в регуляции роста Helicobacter pylori и активности провоспалительных факторов вирулентности ¹⁸ .

H. pylori поражает желудок примерно у половины человечества; Что делает его одним из самых успешных бактериальных патогенов ¹⁹ . Инфекция H. pylori может привести к значительным исходам желудочно-кишечного тракта, включая гастрит, язвенную болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, лимфому, связанную с слизистой оболочкой (MALT), и инвазивную аденокарциному желудка (рак желудка). Рак желудка является ведущей причиной смертности от рака, связанного с некардиамой в мире, и единственным крупнейшим связанным фактором риска развития рака желудка является инфекция H. pylori .

H. pylori сохраняется в желудочной нише, несмотря на robuЙ иммунной реакции на патоген, что подчеркивает необходимость лучшего понимания иммунных механизмов борьбы с этой бактериальной инфекцией ^{20 , 21 , 22 , 23} . H. pylori- ассоциированное воспаление характеризуется глубокой инфильтрацией полиморфноядерных клеток или нейтрофилов, которые отлагают репертуар антимикробных белков, включая S100A12, в месте заражения ^{18 , 24 , 25} . Стремясь понять сложный диалог между хозяином и возбудителем, мы стремились усовершенствовать методику очистки S100A12 и использовать ее для изучения антимикробного воздействия, которое она оказывает на этого с медицинской точки зрения патогена. В приведенном ниже протоколе описан усовершенствованный метод очистки S100A12 в его биологически активном состоянии; Способный связывать питательные металлы с высоким аффиниТи и хелатируя их от вторгающихся микроорганизмов. Кроме того, приведенные ниже методы подчеркивают полезность этого белка как критического реагента для изучения механизма, посредством которого врожденные антимикробные молекулы ограничивают рост бактериальных патогенов.

Белок семейства S100A получил признание как важная группа врожденных молекул иммунной системы, которые участвуют в иммунной передаче сигналов, а также в защите хозяина ²⁷ . Наиболее хорошо изученными из них являются кальпротектин (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) ^{28 , 29 , 30} . Кальпротектин представляет собой связанный с нейтрофилом белок, который образует гетеродимер субъединиц S100A8 и S100A9, который связывает переходные металлы на границе димера ³¹ . Было показано, что кальпротектин обладает двумя местами связывания металлов: участок 1 может связывать Zn ²⁺ , Mn ²⁺ или Fe ²⁺ , а сайт 2 может Связывают Zn ^{2+ 31 , 32} . Многочисленные сообщения показали, что кальпротектин обладает противомикробной активностью в отношении различных патогенных микроорганизмов, включая Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli и H.pylori , и что ингибирующее действие обусловлено хелатной активностью металлов ^{25 , 28 , 29} .

Предыдущая работа продемонстрировала, что капротектин проявляет многочисленные активности в отношении H. pylori, включая изменение структуры липида А во внешней мембране, подавление системы секреции cag-типа IV (которая является основным провоспалительным фактором вирулентности в H. pylori ), индуцируя образование биопленки и подавление Рост и жизнеспособность H. pylori в зависимости от дозыClass = "xref"> 25 ^{, 33} . Кроме того, генетические и биохимические анализы показали, что антибактериальная активность кальпротектина против H. pylori в значительной степени обусловлена ​​его способностью связывать питательный цинк ²⁵ . H. pylori нуждается в цинке, как это было определено предыдущими исследованиями, в которых использовалась химически определенная среда, чтобы определить потребности в микроэлементах, чтобы этот патоген мог расти и размножаться ³⁴ . Кроме того, кальпротектин был очень распространен в тканях, зараженных H.pylori , и связан с нейтрофильными инфильтратами, что указывает на то, что хозяин может использовать кальпротектин в качестве антимикробной стратегии при инфицировании и последующем воспалении ^{25 , 35} .

Недавние данные, полученные в результате несвязанных методов скрининга протеомики, свидетельствуют о том, что в условиях, когда активные формы кислорода многочисленны, calprotecОлово подвергается посттрансляционным модификациям, которые изменяют сайт связывания гексагистидина, тем самым ингибируя металлосвязывающую активность белка ³⁶ . Таким образом, мы предположили, что другие белки семейства S100A в широком репертуаре этих молекул могут потенциально выступать в качестве вспомогательных металл-хелаторов. Мы выбрали S100A12 для дальнейшего исследования, потому что он не был идентифицирован на вышеупомянутом экране для посттрансляционной модификации, он обладает способностью связывать цинк, и он очень распространен в тканях человека, полученных от инфицированных H. pylori индивидуумов.

Наша работа показывает, что S100A12 может ингибировать рост и жизнеспособность H.pylori дозозависимым образом в G27 штамме H.pylori и что антимикробная активность этого белка может быть обращена путем добавления избытка питательного цинка. Эта работа дополняет нашу предыдущую работу, показывающую, что S100A12 проявляет противомикробную активность против PMSS1 и 7.13 штаммов H.pylori , демонстрируя его широкую антибактериальную активность против многочисленных клинических изолятов и лабораторно адаптированных штаммов H.pylori ¹⁸ . Вместе эти результаты подтверждают важность S100A12 в качестве механизма для контроля роста и пролиферации бактерий с помощью питательного иммунитета. Будущие исследования этого важного взаимодействия между хозяином и бактерией могут включать в себя использование активности S100A12 для снижения бактериальной нагрузки в тканях организма-хозяина или определения вклада этого белка в иммунную передачу сигналов в контексте инфекции H.pylori .