Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

As prote�as S100 s� uma classe da fam�ia EF-hand de prote�as de liga�o de c�cio com uma diversidade de fun�es ¹ . Eles são expressos de uma forma específica de tecidos e células, e regulam um amplo espectro de funções celulares ^{2 , 3} . Exclusivas para proteínas de ligação ao cálcio, as proteínas S100 exibem funções intracelulares e extracelulares ^{4 , 5} . Dentro da célula, a ligação de Ca2 ⁺ induz uma alteração conformacional que expõe uma superfície hidrofóbica que alveja especificamente parceiros de ligação à proteína ⁶ . Este mecanismo intracelular regula processos importantes como proliferação celular, diferenciação e metabolismo energético. No meio extracelular, as proteínas S100 exibem duas funções ⁷ . Num deles, actuam como proteínas associadas a padrões moleculares associados (DAMP) e iniciam uma pró-inflamaçãoResposta imune atórica através da interação com receptores de reconhecimento de padrão ^{8 , 9} . Além disso, vários membros da classe de proteínas S100 sequestam metais de transição, uma função que serve para privar patógenos microbianos em um processo denominado imunidade nutricional ^{10 , 11} .

S100A12 (também conhecida como calgranulina C e EN-RAGE) é altamente expressa em macrófagos e neutrófilos e tem sido identificada como potencial biomarcador para doenças inflamatórias ^12,13 . Além de ligar o cálcio nos seus locais EF-Hand, S100A12 tem dois locais de ligação de metais de transição de alta afinidade localizados em extremidades opostas da interface dimérica ^{14 , 15} . Cada sítio de ligação é constituído por três resíduos de histidina e um resíduo de ácido aspártico e pode quelar zinco ou cobre <Sup class = "xref"> 16 ^{, 17} . Recentemente, relatamos que a fome de zinco dependente de S100A12 é importante na regulação do crescimento de Helicobacter pylori e da atividade de fatores de virulência pró-inflamatórios ¹⁸ .

H. pylori infecta o estômago de cerca de metade da população humana do mundo; Tornando-se sem dúvida um dos mais bem sucedidos patógenos bacterianos [ ^19] . A infecção com H. pylori pode levar a resultados significativos da doença gástrica incluindo gastrite, úlcera péptica e duodenal, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT) e adenocarcinoma gástrico invasivo (câncer de estômago). O câncer de estômago é a principal causa de morte associada ao câncer de não-cardia no mundo, eo maior fator de risco associado para câncer de estômago é a infecção por H. pylori .

H. pylori persiste no nicho gástrico apesar de um robuSt resposta imune ao patógeno, sublinhando a necessidade de uma melhor compreensão dos mecanismos imunes de controle desta infecção bacteriana ^{20 , 21 , 22 , 23} . A inflamação associada ao H. pylori é caracterizada por uma profunda infiltração de células polimorfonucleares, ou neutrófilos, que depositam um repertório de proteínas antimicrobianas, incluindo S100A12, no local da infecção ^{18 , 24 , 25} . Em um esforço para entender o complexo diálogo entre hospedeiro e patógeno, buscamos refinar a técnica para purificar S100A12 e usá-lo para estudar o efeito antimicrobiano que exerce sobre este patógeno clinicamente relevante. O protocolo abaixo descreve uma técnica melhorada para a purificação de S100A12 no seu estado biologicamente activo; Capazes de se ligar a metais nutrientes com altaE eliminando-os de microrganismos invasores. Além disso, os métodos abaixo destacam a utilidade desta proteína como um reagente crítico para estudar o mecanismo pelo qual as moléculas antimicrobianas inatas restringem o crescimento de patógenos bacterianos.

As proteínas da família S100A ganharam apreciação como um importante grupo de moléculas do sistema imune inatas que participam na sinalização imune bem como na defesa do hospedeiro ²⁷ . O mais bem estudado destes é a calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) ^{28 , 29 , 30} . A calprotectina é uma proteína associada a neutrófilos que forma um heterodímero das subunidades S100A8 e S100A9 que liga metais de transição na interface dímero ³¹ . Verificou-se que a calprotectina possui dois locais de ligação de metal: o local 1 pode ligar Zn2 ⁺ , Mn2 ⁺ ou Fe2 ⁺ e o sítio 2 pode Se Zn2 ^{+ 31 , 32} . Numerosos relatos demonstraram que a calprotectina tem atividades antimicrobianas contra diversos agentes patogênicos incluindo Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli e H. pylori e que os efeitos inibitórios são devidos à atividade de quelação de metal da calprotectina 25,28 ^{, 29} .

Trabalhos anteriores demonstraram que a calprotectina exerce numerosas atividades sobre H. pylori, incluindo a alteração da estrutura do lípido A na membrana externa, reprimindo o sistema de secreção tipo IV (que é um importante fator de virulência proinflamatório dentro de H. pylori ), induzindo a formação de biofilme e reprimindo Crescimento e viabilidade de H. pylori de uma forma dependente da doseClass = "xref"> 25 ^{, 33} . Além disso, os ensaios genéticos e bioquímicos revelaram que a actividade antibacteriana da calprotectina contra H. pylori foi largamente derivada da sua capacidade para ligar o zinco nutriente ²⁵ . H. pylori requer zinco, como foi determinado por pesquisas anteriores, que utilizou um meio quimicamente definido para determinar os requisitos de micronutrientes para este patógeno para crescer e proliferar [ ^34] . Além disso, a calprotectina foi altamente abundante nos tecidos infectados com H. pylori e associada a infiltrados neutrófilos, indicando que o hospedeiro pode empregar calprotectina como estratégia antimicrobiana durante a infecção e subseqüente inflamação 25,35.

Evidências recentes de técnicas de triagem proteômica não-direcionadas sugerem que sob condições onde espécies reativas de oxigênio são abundantes, calprotecO estanho sofre modificações pós-translacionais que alteram o local de ligação da hexa-histidina, inibindo assim a actividade de ligação do metal da proteína ³⁶ . Como tal, nós hipotetizamos que outras proteínas da família S100A entre o vasto repertório dessas moléculas poderiam potencialmente atuar como quelantes metálicos auxiliares. Seleccionou-se S100A12 para estudo adicional porque não foi identificado no referido ecrã para modificação pós-tradução, tem a capacidade de ligar o zinco e é altamente abundante em tecidos humanos derivados de indivíduos infectados com H. pylori .

O nosso trabalho indica que S100A12 pode inibir o crescimento ea viabilidade de H. pylori de uma forma dependente da dose na estirpe G27 de H. pylori , e que a actividade antimicrobiana desta proteína pode ser invertida pela adição de zinco em excesso de nutrientes. Este trabalho complementa o nosso trabalho anterior indicando S100A12 exerceram atividade antimicrobiana contra PMSS1 e 7.13 de H. pylori , demonstrando sua ampla atividade antibacteriana contra numerosos isolados clínicos e linhagens de H. pylori adaptadas ao laboratório ¹⁸ . Juntos, estes resultados confirmam a importância de S100A12 como um mecanismo para controlar o crescimento bacteriano e proliferação via imunidade nutricional. Futuros estudos desta importante interacção hospedeiro-bactéria poderiam incluir explorar a actividade de S100A12 para reduzir a carga bacteriana dentro dos tecidos do hospedeiro ou determinar a contribuição desta proteína para a sinalização imune no contexto da infecção por H. pylori .