Expression, purification et activité antimicrobienne de S100A12

Les protéines S100 sont une classe de la famille EF de protéines de liaison au calcium avec un éventail varié de fonctions ¹ . Ils sont exprimés de manière spécifique aux tissus et aux cellules et régulent un large éventail de fonctions cellulaires ^{2 , 3} . Les protéines S100 sont exclusives aux protéines de liaison au calcium et présentent des fonctions intracellulaires et extracellulaires ^{4 , 5} . Dans la cellule, la liaison au Ca ²⁺ induit un changement de conformation qui expose une surface hydrophobe qui cible spécifiquement les partenaires de liaison aux protéines ⁶ . Ce mécanisme intracellulaire regroupe des processus importants tels que la prolifération cellulaire, la différenciation et le métabolisme énergétique. Dans le milieu extracellulaire, les protéines S100 présentent deux fonctions ⁷ . Dans un, ils agissent comme des protéines associées à un motif moléculaire associé (DAMP) et initient un pro-inflammatoireRéponse immunitaire de l'administration par l'interaction avec les récepteurs de reconnaissance de formes ^{8 , 9} . De plus, plusieurs membres de la classe de protéines S100 séquestrent des métaux de transition, une fonction qui sert à affamer les agents pathogènes microbiens dans un processus appelé immunité nutritionnelle ^{10 , 11} .

S100A12 (également connu sous le nom de calgranuline C et EN-RAGE) est fortement exprimé dans les macrophages et les neutrophiles et a été identifié comme un biomarqueur potentiel pour les maladies inflammatoires ^{12 , 13} . En plus de la liaison du calcium sur ses sites EF-Hand, S100A12 comporte deux sites de liaison de métal de transition à haute affinité situés aux extrémités opposées de l'interface dimère ^{14 , 15} . Chaque site de liaison est composé de trois résidus d'histidine et d'un résidu d'acide aspartique et peut chélater le zinc ou le cuivre <Sup class = "xref"> 16 ^{, 17} . Récemment, nous avons signalé que la famine de zinc dépendante de S100A12 est importante pour réguler la croissance de Helicobacter pylori et l'activité de facteurs de virulence pro-inflammatoires ¹⁸ .

H. pylori infecte l'estomac d'environ la moitié de la population humaine mondiale; Ce qui fait sans doute l'un des agents pathogènes bactériens les plus réussis ¹⁹ . L'infection par H. pylori peut conduire à des résultats significatifs de la maladie gastrique, y compris la gastrite, l'ulcère peptique et duodénal, le lymphome du tissu lymphoïde associé à la muqueuse (MALT) et l'adénocarcinome gastrique invasif (cancer de l'estomac). Le cancer de l'estomac est la principale cause de décès par cancer non cardiaque dans le monde et le plus grand facteur de risque associé au cancer de l'estomac est une infection par H. pylori .

H. pylori persiste dans la niche gastrique malgré un robouSt réponse immunitaire à l'agent pathogène, soulignant la nécessité d'une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires de lutte contre cette infection bactérienne ^{20 , 21 , 22 , 23} . L' inflammation associée à H. pylori est caractérisée par une infiltration profonde des cellules polymorphonucléaires, ou des neutrophiles, qui déposent un répertoire de protéines antimicrobiennes, y compris S100A12, au site d'infection ^{18 , 24 , 25} . Dans le but de comprendre le dialogue complexe entre l'hôte et l'agent pathogène, nous avons cherché à affiner la technique pour purifier le S100A12 et l'utiliser pour étudier l'effet antimicrobien qu'il exerce sur ce pathogène médicalement pertinent. Le protocole ci-dessous décrit une technique améliorée pour la purification de S100A12 dans son état biologiquement actif; Capable de lier des métaux nutritifs avec des affini élevésEt les chélage des microorganismes envahissants. En outre, les méthodes ci-dessous mettent en évidence l'utilité de cette protéine en tant que réactif critique pour étudier le mécanisme par lequel les molécules antimicrobiennes innées limitent la croissance des agents pathogènes bactériens.

Les protéines de la famille S100A se sont accrues en tant que groupe important de molécules du système immunitaire inné qui participent à la signalisation immunitaire ainsi qu'à la défense de l'hôte ²⁷ . Le plus bien étudié est la calprotectine (MRP-8/14, calgranuline A / B, S100A8 / A9) ^{28 , 29 , 30} . La calprotéctine est une protéine associée aux neutrophiles qui forme un hétérodimère des sous-unités S100A8 et S100A9 qui se lient aux métaux de transition à l'interface dimère ³¹ . On a montré que la calprotéctine possède deux sites de liaison métallique: le site 1 peut lier Zn ²⁺ , Mn ²⁺ ou Fe ²⁺ , et le site 2 peut Liez Zn ^{2+ 31 , 32} . De nombreux rapports ont démontré que la calprotectine a des activités antimicrobiennes contre divers agents pathogènes, y compris Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli et H. pylori , et que les effets inhibiteurs sont dus à l'activité de chélation du métal de la calprotectine ^{25 , 28 , 29} .

Les travaux antérieurs démontrent que la calprotectine exerce de nombreuses activités sur H. pylori, y compris la modification de la structure de lipide A dans la membrane externe, la rétention du système de sécrétion de type IV (qui est un facteur de virulence proinflammatoire majeur au sein de H. pylori ), induisant une formation de biofilm et réprimant La croissance et la viabilité de H. pylori de manière dose-dépendanteClass = "xref"> 25 ^{, 33} . De plus, les études génétiques et biochimiques révèlent que l'activité antibactérienne de la calprotectine contre H. pylori découle en grande partie de sa capacité à lier le zinc nutritif ²⁵ . H. pylori requiert du zinc, comme l'ont déterminé les recherches précédentes, qui utilisaient un milieu chimiquement défini pour déterminer les besoins en micronutriments pour que ce pathogène se développe et prolifère ³⁴ . En outre, la calprotectine était très abondante dans les tissus infectés par H. pylori et associée à des infiltrats neutrophiles, ce qui indique que l'hôte peut utiliser la calprotectine comme stratégie antimicrobienne pendant l'infection et une inflammation subséquente ^{25 , 35} .

Des preuves récentes provenant de techniques de dépistage protéomiques impartiales suggèrent que, dans des conditions où les espèces réactives d'oxygène sont nombreuses, CalprotecL'étain subit des modifications post-traductionnelles qui modifient le site de liaison de l'hexa-histidine, inhibant ainsi l'activité de liaison de métal de la protéine ³⁶ . En tant que tel, nous avons émis l'hypothèse que d'autres protéines de la famille S100A parmi le large répertoire de ces molécules pourraient potentiellement agir comme des chélateurs métalliques auxiliaires. Nous avons sélectionné S100A12 pour une étude approfondie car il n'a pas été identifié dans l'écran précité pour la modification post-traductionnelle, il a la capacité de lier le zinc et il est très abondant dans les tissus humains dérivés des individus infectés par H. pylori .

Notre travail indique que S100A12 peut inhiber la croissance et la viabilité de H. pylori de manière dose-dépendante dans la souche G27 de H. pylori et que l'activité antimicrobienne de cette protéine peut être inversée par l'ajout d'excès de nutriment au zinc. Ce travail complète notre travail précédent indiquant que S100A12 a exercé une activité antimicrobienne contre PMSS1 et 7.13 souches de H. pylori , démontrant sa large activité antibactérienne contre de nombreux isolats cliniques et souches adaptées au laboratoire de H. pylori ¹⁸ . Ensemble, ces résultats confirment l'importance du S100A12 comme mécanisme de lutte contre la prolifération et la prolifération des bactéries par immunité nutritionnelle. Des études futures de cette importante interaction hôte-bactérienne pourraient inclure l'exploitation de l'activité de S100A12 pour réduire le fardeau bactérien dans les tissus de l'hôte ou déterminer la contribution de cette protéine à la signalisation immunitaire dans le contexte de l' infection par H. pylori .