Summary

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Published: April 05, 2017
doi:

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von Precision-cut Lung Slices (PCLS) und immunostaining sie die Lokalisierung verschiedenen Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Unser Protokoll kann erweitert werden, um die Position und Funktion vieler verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu visualisieren.

Abstract

Inhalation von Allergenen und Krankheitserregern entlockt mehrere Änderungen in einer Vielzahl von Immunzelltypen in der Lunge. Die Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Technik für die quantitative Analyse von Zelloberflächenproteinen auf Immunzellen, aber es gibt keine Informationen über die Lokalisierung und Migrationsmuster dieser Zellen in der Lunge. In ähnlicher Weise kann Chemotaxis – Assays durchgeführt werden , um das Potenzial der Zellen zu untersuchen , um chemotaktische Faktoren in vitro zu reagieren, aber diese Tests nicht die komplexe Umgebung des intakten Lunge reproduzieren. Im Gegensatz zu diesen oben genannten Techniken kann die Lage der einzelnen Zelltypen innerhalb der Lunge leicht durch Erzeugen von präzisionsgeschliffenen Lung Slices (PCLS), Anfärben sie mit handelsüblichen, fluoreszenzmarkierten Antikörpern und Visualisierungen der Abschnitte durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht werden. PCLS kann für beide verwendet werden, leben und Lungengewebe fixiert ist, und die Scheiben Bereiche so groß wie ein Querschnitt einer gesamten Lappen umfassen kann. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um erfolgreich die Position eine Vielzahl von Zelltypen in der Lunge, einschließlich verschiedenen Arten von dendritischen Zellen sichtbar zu machen, Makrophagen, Neutrophile, T-Zellen und B-Zellen, sowie Strukturzellen wie Lymph-, endotheliale und Epithelzellen. Die Fähigkeit, zelluläre Interaktionen sichtbar zu machen, wie die zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen, live, dreidimensionalen Lungengeweben kann zeigen, wie Zellen in der Lunge bewegen und miteinander in einem stabilen Zustand und während der Entzündung in Wechselwirkung treten. Somit wird, wenn in Kombination mit anderen Verfahren, wie Durchflusszytometrie und quantitative PCR verwendet wird, kann PCLS zu einem umfassenden Verständnis von zellulären Ereignissen beitragen, die allergischen und entzündlichen Erkrankungen der Lunge zu Grunde liegen.

Introduction

Nach Einatmen von proinflammatorischen Stimuli wie Lipopolysaccharide (LPS), gibt es eine koordinierte Bewegung von Immunzellen in die, innerhalb und aus der Lunge. Zum Beispiel werden Neutrophile Lungenparenchym und Atemwegs schnell rekrutiert. Darüber hinaus sind einige professionelle antigenpräsentierende als herkömmliche dendritische Zellen (cDCs) bekannten Zellen durchlaufen eine relativ komplizierte Migrationsmuster 1, 2. cDCs kann CD11c auf ihrer Anzeige des Oberflächenmarker, unter Verwendung von identifizierte Durchflusszytometrie, basierend teilweise. Distinct Subsets von DCs können durch die Differentialoberflächenexpression von CD11b CD103 und 3 unterschieden werden. Bei inhalativen Antigen Erwerb verlassen einige cDCs die Lunge und wandern durch die Lymphgefäße zu Lungen-Lymphknoten (LNS) , wo sie Peptide präsentieren 4 T – Zellen-spezifisches Antigen. Dies ist ein kritisches frühes Ereignis in der Einleitung der adaptiven Immun rAHMEN. Aus unbekannten Gründen jedoch nicht alle cDCs , die inhaliert Antigene erwerben lassen , die Lunge, und viele dieser Zellen bleiben in diesem Organ für mehrere Monate 5, 6. Diese Beobachtung kann teilweise durch die Entwicklungs Vorfahren dieser Zellen , da Monozyten abgeleiteten Zellen CD11c + erklärt werden , um den Chemokin – Rezeptor fehlen, CCR7, sind nicht in der Lage zu regionalen LNs 7, 8 zu wandern. Es scheint wahrscheinlich, dass das Migrationspotenzial von cDCs auch bestimmt ist, zumindest teilweise durch ihre anatomische Position innerhalb der Lunge. Jedoch ist die genaue Lokalisierung dieser verschiedenen Populationen von cDCs in der Lunge nicht vollständig charakterisiert. Eine verbesserte Kenntnis von Immunzellen Lokalisation innerhalb der Lunge und des Moleküls, die sie leiten, ist für ein besseres Verständnis davon, wie das Immunsystem der Lunge benötigt wird aktiviert.

PCLS werden steigendely verwendete als exvivo – Ansatz zellulare Positionierung und Zell-Zell – Wechselwirkungen sichtbar zu machen , während die strukturelle Integrität der Lungenarchitektur 9, 10 aufrechterhalten wird . PCLS wurden verwendet Lungen vielen Arten zu untersuchen, darunter Mäuse, Rinder, Affen, Schafe, Pferde und Menschen 11. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik besteht darin, dass etwa 20 Scheiben aus einer einzigen Keule einer Mauslunge hergestellt werden können, wodurch die Anzahl von Tieren für die einzelnen Versuche benötigt reduzieren. Praktisch alle Immunzelltypen, einschließlich DCs, Makrophagen, Neutrophile und T-Zellen, sind in PCLS und pflegen ihre normalen Strukturen.

PCLS 13 kann auch mit Acetylcholin oder Methacholin 12 zu studieren Calcium – Signalisierung und die Kontraktilität des Atemweg und glatten Muskelzellen nach der Behandlung verwendet werden. Bei diesem Ansatz ist nur ein kleiner Teil der Lunge einalyzed mikroskopisch, aber eine Studie berichtete , dass die Messungen der Atemwegskontraktion in PCLS nur etwa 10% von der Scheibe variieren zu schneiden, und diese Varianz vergleichbar ist , das zu 14 in intakten Tieren unter Verwendung von Lungenfunktionstests beobachtet. Andere Forscher haben PCLS als Exvivo – Ansatz verwendet zu untersuchen Veränderungen in der Zytokin – Expression und Zelloberflächenmarker nach der Inkubation mit LPS 15. PCLS haben auch in einem ex vivo – Modell der hypoxischen pulmonalen Vasokonstriktion in kleinen intra acinar Arterien eingesetzt. Diese Schiffe sind im Teil der Lunge entfernt , die mit anderen Verfahren nicht erreicht werden können, darunter Aufnahmen von sezierten arterielle Segmenten oder Analyse von subpleural Gefäßen 16. Unser Labor hat PCLS zu visualisieren Immunzellortung in lebenden Lungengeweben in einem stabilen Zustand und nach einem Invivo – Entzündungsreiz eingesetzt. Die Verfahren haben wir dafür entwickelt wurden, sind wie folgt.

Protocol

Tierversuchsverfahren in diesem Dokument beschrieben sind, wurden durch die NIEHS Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. 1. Lung Vorbereitung Hausmäuse zwischen 6 und 12 Wochen alt ist in spezifischen pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüssen vorgesehen Richtlinien. HINWEIS: Abgebildete Mäuse können entweder naiv oder behandelt sein, abhängig von jedem spezifischen Interessen des Forsch…

Representative Results

Um die Position von zwei DC – Untergruppen, CD11b hallo cDCs und CD103 + cDCs, PCLS von C57BL / 6 – Mäusen wurden geschnitten und gefärbt mit monoklonalen Antikörpern (mAb) , spezifisch für CD11c, CD88, CD103 und CD324 (E-Cadherin) zu identifizieren. Antikörper gegen CD324 stain Atemwegsepithelzellen und CD88 auf Makrophagen und Neutrophile angezeigt, aber nicht mehr als 8 cDCs. Dies ermöglichte es uns cDCs von CD11c + Makrop…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll wurde ursprünglich die Positionen von zwei Untergruppen von cDCs in der Lunge sichtbar zu machen entwickelt. Jedoch kann dieses Protokoll ohne weiteres viele verschiedene Zelltypen zu untersuchen, während die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen und die dreidimensionale Architektur der Lunge angepasst werden. Das letztere Merkmal ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber Kultursysteme Zelle und erleichtert die Identifizierung von seltenen Zelltypen. Das Verfahren beruht auf d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Jeff Tucker, Erica Scappini und Agnes Janoshazi für ihre Hilfe bei der Mikroskopie Ligon Perrow für ihre Verwaltung der Maus Kolonie, und Jun Chen und Michael Sanderson um Hilfe mit dem Gewebe Hobel, und Michael Fessler und Derek Cain für kritische Lektüre das Manuskript. Diese Arbeit wurde durch den intra-Zweig des NIEHS, NIH (ZIA ES102025-09) finanziert, die von der Abteilung für Gesundheit und Human Services gesponsert wiederum.

Materials

C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
Prox1-TdTomato transgenic mice  Jackson Laboratory 018128 B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice Jackson Laboratory 004194, 006617 B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J 
Rag1 knock-out mice Jackson Laboratory 002216 B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, Purified Worthington Biochemical Corporation LS003059
Lipopolysaccharides from Escherichia coli Sigma-Aldrich Co. L2630-25MG
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft BD Diagnostic Systems 427421 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose BioExpress E-3112-125 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C.
Compresstome VF-300 Precisionary Instruments, Inc. VF-300
Double Edge Stainless Razor Blade Electron Microscopy Sciences 72000 Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.
Krazy Glue All Purpose Instant Gel VWR 500033-484 Commonly available for $3/tube in local drugstores 
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red ThermoFisher Scientific 21083027
Normal Rat Serum Jackson ImmunoResearch Inc. 012-000-120
Normal Mouse Serum Jackson ImmunoResearch Inc. 015-000-120
Fetal bovine serum Hyclone SH30071.03HI
Staining Buffer Made in House N/A PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) Made in House N/A Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2
Anti-mouse CD11b eFluor 450 eBioscience 48-0112-80 Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) 
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 BioLegend 101237 Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin eBioscience 12-0114-82 PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin BD Phamingen 550261 APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin BioLegend 135806 PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin eBioscience 17-1031-82 Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 eBioscience 48-0902-82 Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin eBioscience 17-1721-82 Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 BD Horizon 564188 BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 eBioscience 53-3249-82 Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 eBioscience 51-3249-82 Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)
Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass MatTek Corperation P35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ThermoFisher Scientific 155411PK  Pack of 16
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness MatTek Corperation PCS-1.5-15
Bare Platinum Wire World Precision Instruments PTP201 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36934 Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free Corning 356231
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope Carl Zeiss Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends Carl Zeiss 420650-9901-000

References

  1. Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
  2. Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
  3. Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
  4. Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
  5. Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
  6. Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
  7. Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
  8. Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
  9. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
  10. Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
  11. Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
  12. Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
  13. Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
  14. Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
  15. Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
  16. Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
  17. Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
  18. Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
  19. Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
  20. Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
  21. Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
  22. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).

Play Video

Cite This Article
Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (122), e55465, doi:10.3791/55465 (2017).

View Video