Summary

Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol<em> Clostridium difficile</em> Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek

Published: May 25, 2017
doi:

Summary

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Abstract

Anaerobik bakterilere yönelik yeni ilaç geliştirme ile antibiyotik eyleminin değerlendirilmesi zor ve teknik olarak zorunludur. Olası MOA'yı anlamak için antibiyotik maruziyeti ile ilişkili morfolojik değişiklikler taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak görüntülenebilir. SEM görüntülemeyi geleneksel öldürme eğrileri ile bütünleştirmek ilaç eylemi konusundaki görüşümüzü geliştirebilir ve ilaç geliştirme sürecini ilerletebilir. Bu önceliği test etmek için, eğrileri öldürün ve SEM çalışmaları, bilinen fakat farklı MOA'lı (vankomisin ve metronidazol) ilaçlarla gerçekleştirildi. C. difficile hücreleri (R20291) 48 saate kadar antibiyotik varlığında veya yokluğunda yetiştirildi. 48 saatlik aralık boyunca, antibiyotik etkinliğini belirlemek ve SEM'de görüntüleme yapmak için hücreler çoklu zaman noktalarında toplandı. Önceki raporlarla uyumlu olarak, vankomisin ve metronidazolün, koloni oluşturan birim (CFU) konseyleri ile ölçülen 24 saatlik tedaviyi takiben önemli miktarda bakterisid aktivitesi vardıting. SEM görüntüleme yöntemini kullanarak, metronidazolün, kontroller ve vankomisin ile karşılaştırıldığında hücre uzunluğu (her bir antibiyotik için hücre uzunluğunda>% 50 azalma; P <0.05) üzerine önemli etkileri olduğunu saptadık. İlaç tedavisine fenotipik tepki daha önce bu şekilde belgelenmemesine karşın, ilacın MOA'sıyla tutarlıdır ve görüntüleme ve ölçümlerin çok yönlülüğü ve güvenilirliği ile bu tekniğin diğer deneysel bileşikler için uygulanmasını göstermektedir.

Introduction

Clostridium difficile , gram pozitif, spor oluşturan bir bakteridir ve ABD'de yılda yaklaşık 500.000 enfeksiyona neden olur ve en yüksek risk seviyesi olan Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından bir tehdit seviyesi acil patojen olarak değerlendirilir. Son on yılda, C. difficile'ye karşı aktivite gösteren antimikrobiyallerde önemli ilaç geliştirme görüldü . 2 , 3 İn vitro çalışmalar ilaç geliştirme sürecinin gerekli bir bileşenidir. Geleneksel olarak, in vitro duyarlılık ve zaman öldürme çalışmaları gelecek hayvan ve diğer in vivo çalışmaların geçerliliğini doğrulamak için kullanılır.

Bu yöntemler öldürme eylemini değerlendirmek için önemli bir rol oynamakla birlikte, hücrelerin farmakolojik tedaviye fenotipik tepki vermezler. Taramalı elektron mikroskopisi (SEM) standart ile birleştirilerekKinetik çalışmaları öldürdüğünde, antibiyotik direkt etkilerinin daha ayrıntılı bir şekilde tanımlanması mümkündür. 5 , 6 , 7 Burada, SEM'in antibiyotik tedavisinin etkililiğini gösteren bir araç olarak kullanıldığı bir yöntem sunuyoruz.

Protocol

1. Farklı çevre veya klinik kaynaklardan C. difficile'nin izolasyonu Çevresel izolatlar: Önceden sterilize edilmiş bir pamuk göstergesi (hafifçe 0,85% NaCl ile ıslatılmış) kullanarak herhangi bir alanın yüzeyini (zemin, kapı, kol, raf vb. ) Sürünüz. 8 Steril eldiven giydiğinizden ve svabın tamamlandıktan sonra sterilize edilmiş bir tüpe konulduğundan emin olun. Klinik izolatlar (dışkı): Bir aşılama döngüsünü kullanarak 10 …

Representative Results

Clostridium difficile , spor oluşturan bir bakteridir ve bu nedenle herhangi bir fonksiyonel analizden önce vejetatif ve spor hücreleri arasındaki morfoloji farklılıklarını belirlemek esastır. Şekil 1 , büyüme eğrisinin üstel fazında ve spor hücrelerinde yakalanan vejetatif hücrelerin temsili görüntülerini göstermektedir. Resimde görüldüğü gibi vejetatif hücreler uzun, pürüzsüz, çubuk şeklinde yapılarken, sporlar kaba bir dış g…

Discussion

Bu çalışmanın amacı, C. difficile'yi izole etmek için yüksek verimli bir yöntem oluşturmak ve antibiyotik farmakolojik etkisinin daha kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesi için bir araç olarak taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak antibiyotik duyarlılığını test etmektir. Burada özetlenen protokolleri kullanarak, hücrenin antibiyotik tedavisine fenotipik tepki görüntülemenin ilacın farmakolojik etkisine dair bilgiler sağlayabileceğini gösterdik. Toplamda, bu p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.

Materials

cotton gauze  Caring PRM21408C
NaCl Macron 7532
50mL tubes Falcon 352098
Brain Heart Infusion (BHI)  Criterion C5141
L-cysteine Alfa Aesar A10389
yeast extract Criterion C741
sodium taurocholate Alfa Aesar A18346
anaerobic chamber Coy vinyl anaerobic chamber
cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates Anaerobe systems AS-213
blood agar plates Hardy diagnostics A-10
latex agglutination reagent Oxoid DR1107A C. diff test kit
microcentrifuge tubes Eppendorf 222363204
PBS Gibco 10010-031
4% paraformaldehyde Fisher Scientific 50-259-98
microscope slides J. Melvin freed brand 7525M 75x25mm
flow hood Labconco Class II type A2  biosafety cabinet
desk sputtering machine Denton Vacuum Desk II
tape Plastic Core 05072-AB SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape
gold Denton Vacuum TAR001-0158 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil
scanning electron microscope FEI XL-30

References

  1. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  2. Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
  3. Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
  4. Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
  5. Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
  6. Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
  7. Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
  8. Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
  9. Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
  10. Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
  11. Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
  12. Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
  13. Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
  14. McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).

Play Video

Cite This Article
Endres, B., Bassères, E., Rashid, T., Chang, L., Alam, M. J., Garey, K. W. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. J. Vis. Exp. (123), e55383, doi:10.3791/55383 (2017).

View Video