Протокол для характеристики морфологических изменений<em> Сложный Clostridium</em> В ответ на лечение антибиотиками
Summary
Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.
Abstract
Оценка действия антибиотиков при разработке новых лекарств, направленная на анаэробные бактерии, сложна и технически сложна. Чтобы получить представление о возможном MOA, морфологические изменения, связанные с воздействием антибиотиков, можно визуализировать с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Интеграция СЭМ-изображений с традиционными кривыми убийства может улучшить наше понимание действия лекарств и ускорить процесс разработки лекарственного средства. Чтобы проверить это предположение, кривые убивания и исследования SEM проводились с использованием препаратов с известными, но разными MOA (ванкомицин и метронидазол). C. difficile cells (R20291) выращивали с или без присутствия антибиотика в течение 48 часов. В течение 48-часового интервала клетки собирали в различные моменты времени, чтобы определить эффективность антибиотиков и визуализацию на SEM. В соответствии с предыдущими сообщениями, ванкомицин и метронидазол проявляли значительную бактерицидную активность после 24 ч лечения, измеряемого колониеобразующей единицей (КОЕ) странытин. С помощью СЭМ-изображений мы определили, что метронидазол оказывает значительное влияние на длину клетки (> 50% уменьшение длины клетки для каждого антибиотика, Р <0,05) по сравнению с контролем и ванкомицином. Хотя фенотипический ответ на лечение наркотиками ранее не был описан в этом документе, они согласуются с MOA лекарственного средства, демонстрируя универсальность и надежность изображений и измерений, а также применение этого метода для других экспериментальных соединений.
Introduction
Clostridium difficile является грамположительной спорообразующей бактерией, ежегодно вызывающей около 500 000 инфекций в США, и считается Центром по контролю и профилактике заболеваний (CDC), который является самым опасным уровнем риска. 1 За последнее десятилетие было отмечено значительное развитие лекарств в противомикробных препаратах с активностью против C. difficile . 2 , 3 Исследования in vitro являются необходимым компонентом процесса разработки лекарственного средства. 4 Традиционно исследования in vitro чувствительности и время убивают используются для проверки будущих животных и других исследований in vivo .
Хотя эти методы и играют важную роль для оценки действия убийства, они не учитывают фенотипический ответ клеток на фармакологическое лечение. Путем включения сканирующей электронной микроскопии (SEM) со стандартнымD убийство кинетических исследований, более тщательная характеристика прямого воздействия антибиотиков возможна. 5 , 6 , 7 Здесь мы представляем метод, в котором SEM используется для определения эффективности лечения антибиотиками.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью настоящего исследования было создание высокопроизводительного метода для выделения C. difficile и тестирования восприимчивости к антибиотикам с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) в качестве средства для более полной характеристики фармакологического действия а?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.
Materials
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75x25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
