Een protocol om de morfologische veranderingen van<em> Clostridium difficile</em> In reactie op Antibiotische Behandeling
Summary
Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.
Abstract
Beoordeling van antibiotische werking met nieuwe geneesmiddelontwikkeling gericht op anaërobe bacteriën is moeilijk en technisch veeleisend. Om inzicht te krijgen in mogelijke MOA, kunnen morfologische veranderingen in verband met de blootstelling aan antibiotica worden gedetecteerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Het integreren van SEM imaging met traditionele kill curves kan ons inzicht in drugsactie verbeteren en het drugontwikkelingsproces bevorderen. Om dit uitgangspunt te testen werden dodenkrommen en SEM-studies uitgevoerd met behulp van geneesmiddelen met bekende maar verschillende MOA (vancomycine en metronidazool). C. difficiele cellen (R20291) werden tot 48 uur met of zonder aanwezigheid van antibiotica gegroeid. Gedurende het 48 uur interval werden cellen verzameld op meerdere tijdspunten om de doeltreffendheid van antibiotica te bepalen en voor beeldvorming op de SEM. In overeenstemming met eerdere verslagen had vancomycine en metronidazole significante bactericide activiteit na 24 uur behandeling zoals gemeten door kolonievormende eenheid (CFU) landenting. Met behulp van SEM beeldvorming bleken we dat metronidazol significante effecten op cellengte had (> 50% reductie in cellengte voor elk antibioticum, P <0,05) in vergelijking met controles en vancomycine. Hoewel de fenotypische respons op medicijnbehandeling niet eerder op deze wijze is gedocumenteerd, zijn ze consistent met de MOA van het geneesmiddel, die de veelzijdigheid en betrouwbaarheid van de beeldvorming en metingen en de toepassing van deze techniek voor andere experimentele verbindingen aantoont.
Introduction
Clostridium difficile is een gram positieve , spore-vormende bacterie, die jaarlijks ongeveer 500.000 infecties veroorzaakt in de VS en wordt beschouwd als een dringend ziekteverwekkend patiënt door de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), het hoogste risico. 1 Het afgelopen decennium heeft aanzienlijke drugontwikkeling in antimicrobiële stoffen met activiteit tegen C. difficile gezien . 2 , 3 In vitro studies zijn een noodzakelijk onderdeel van het geneesmiddelontwikkelingsproces. 4 Traditioneel worden in vitro gevoeligheids- en tijddodenstudies gebruikt om toekomstige dieren en andere in vivo studies te valideren.
Hoewel deze methoden een belangrijke rol spelen bij het evalueren van doden, nemen ze de fenotypische reactie van de cellen niet op de farmacologische behandeling vast. Door scanning elektronenmicroscopie (SEM) op te nemen met standarD doden van kinetische studies, is een meer grondige karakterisering van de antibiotische directe effecten mogelijk. 5 , 6 , 7 Hier presenteren wij een methode waarbij SEM gebruikt wordt als middel om de werkzaamheid van antibioticabehandeling te profileren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van de huidige studie was het creëren van een high-throughput methode voor het isoleren van C. difficile en het testen van antibiotica gevoeligheid met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) als middel om een meer grondige karakterisering van de farmacologische werking van het antibiotica. Met behulp van de hierin beschreven protocollen hebben we aangetoond dat beeldvorming van de fenotypische reactie van de cel op antibiotische behandeling inzicht kan geven in de farmacologische werkin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.
Materials
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75x25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
