Un protocole pour caractériser les changements morphologiques de<em> Clostridium difficile</em> En réponse au traitement antibiotique
Summary
Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.
Abstract
L'évaluation de l'action antibiotique avec un nouveau développement de médicament dirigé contre la bactérie anaérobie est difficile et techniquement exigeante. Pour obtenir un aperçu du MOA possible, les changements morphologiques associés à l'exposition aux antibiotiques peuvent être visualisés à l'aide d'une microscopie électronique à balayage (SEM). L'intégration de l'imagerie SEM avec des courbes de destruction traditionnelles peut améliorer notre vision de l'action antidrogue et favoriser le processus de développement de médicaments. Pour tester cette prémisse, les courbes de tuer et les études SEM ont été menées en utilisant des médicaments connus mais différents MOA (vancomycine et métronidazole). Les cellules de C. difficile (R20291) ont été cultivées avec ou sans antibiotiques pendant jusqu'à 48 h. Tout au long de l'intervalle de 48 h, les cellules ont été recueillies à plusieurs moments pour déterminer l'efficacité des antibiotiques et pour l'imagerie sur la SEM. Conformément aux rapports précédents, la vancomycine et le métronidazole ont eu une activité bactéricide significative après 24 heures de traitement, tel que mesuré par un pays de l'unité de colonisation (CFU)Ting. En utilisant l'imagerie SEM, nous avons déterminé que le métronidazole avait des effets significatifs sur la longueur de la cellule (> réduction de 50% de la longueur de la cellule pour chaque antibiotique, P <0,05) par rapport aux témoins et à la vancomycine. Alors que la réponse phénotypique au traitement médicamenteux n'a pas été documentée précédemment de cette manière, elles sont compatibles avec le MOA du médicament démontrant la polyvalence et la fiabilité de l'imagerie et des mesures et l'application de cette technique pour d'autres composés expérimentaux.
Introduction
Clostridium difficile est une bactérie bactérienne positive aux grammes, qui provoque environ 500 000 infections chaque année aux États-Unis et est considéré comme un agent pathogène urgent pour les niveaux de menace par les Centers for Disease Control and Prevention (CDC), le plus haut niveau de risque. 1 La dernière décennie a connu un développement considérable de médicaments chez les antimicrobiens ayant une activité contre C. difficile . 2 , 3 Les études in vitro sont une composante nécessaire du processus de développement de médicaments. 4 Traditionnellement, les études de susceptibilité et de mortalité in vitro sont utilisées pour valider les futures études animales et autres études in vivo .
Bien que ces méthodes jouent un rôle important pour évaluer les actions de destruction, elles ne captent pas la réponse phénotypique des cellules au traitement pharmacologique. En incorporant la microscopie électronique à balayage (SEM) avec standarEn cas d'études cinétiques, une caractérisation plus complète des effets directs des antibiotiques est possible. 5 , 6 , 7 Ici, nous présentons une méthode où la SEM est utilisée comme moyen de profiler l'efficacité du traitement antibiotique.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'objectif de l'étude actuelle était de créer une méthode à haut débit pour isoler C. difficile et tester la sensibilité aux antibiotiques à l'aide d'une microscopie électronique à balayage (SEM) comme moyen pour une caractérisation plus approfondie de l'action pharmacologique de l'antibiotique. En utilisant les protocoles décrits ici, nous avons démontré que l'imagerie de la réponse phénotypique de la cellule au traitement antibiotique peut révéler un aperçu de l&…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.
Materials
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75x25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
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