אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים
Summary
כאן, אנו מציגים גישה האנזימטית לבודד hepatocytes העיקרי של עכברים בוגרים, ואנחנו מתארים כימות של תגובה דלקתית באמצעות ELISA ו- בזמן אמת PCR.
Abstract
הכבד ממלא תפקיד מכריע בוויסות דלקת מערכתית. במחלת כליות כרונית בפרט, הכבד מגיב בתגובה המילייה אורמיה, סטרס חמצוני, endotoxemia ואת אישור ירד מחזורי ציטוקינים מעודדי דלקת על ידי הפקת מספר רב של המגיבים-השלב האקוטי. כלי ניסיוני ללמוד דלקת והתפקיד הבסיסי של hepatocytes הם קריטיים להבנת הרגולציה תרומת ציטוקינים כבדים לתגובה בשלב חריף מערכתית תרחיש הפר דלקתי ממושך, במיוחד בסביבה מורכבת כגון מחלת כליות כרונית. מאז לימוד מנגנונים מורכבים של דלקת in vivo נותר מאתגר, עתירי משאבים ובדרך כלל מחייב את השימוש של חיות טרנסגניות, hepatocytes מבודד העיקרי לספק כלי חזק כדי להשיג תובנות מכניסטית לתוך תגובה חריפה פאזיים בכבד. מאז טכניקה במבחנה זה כוללת עלויות מתונות, גבוה מחדשproducibility וידע טכני משותף, hepatocytes המבודד העיקרי יכולים גם לשמש בקלות כגישת הקרנה. כאן אנו מתארים שיטה אנזימטית מבוססי לבודד hepatocytes murine העיקרי, ואנחנו מתארים את הערכה של תגובה דלקתית בתאים אלה באמצעות ELISA ו- PCR כמותי בזמן אמת.
Introduction
מחלת כליות כרונית (CKD) יכולה להיות מוגדרת כמדינה של דלקת חריפה וכרונית 1. בחולים עם מחלת כליות כרונית, רמות בסרום של גורם גדילה פיברובלסטים הורמון phosphaturic 23 (FGF23) בהדרגה לעלות על מנת לשמור על הומאוסטזיס 2 פוספט בסרום. רמות FGF23 אצלה עלו קשורות באופן עצמאי עם תחלואה ותמותה קרדיו-וסקולרית בקרב חולים אשר מתחילים המודיאליזה טיפול 3, 4. יתר על כן, מספר מחקרים קליניים הראו קשר חזק בין רמות גבוהות FGF23 ורמות של C-reactive protein (CRP), אינטרלאוקין 6 (IL-6) ו גידול נמק α פקטור (TNFα) 5, 6. יתר על כן, במחקר ניסיוני, אנחנו הוכחנו לאחרונה כי FGF23 יכול למקד ישירות hepatocytes ולגרום לתגובה דלקתית על ידי הגדלת CRP ו- IL-6 עמ 'roduction בכבד 7. לפיכך, FGF23 עשוי לפעול כגורם במחזור שתורם דלקת מערכתית CKD.
בשנות ה -70 המוקדמות, hepatocytes העיקרי היו מבודדים למד בפעם הראשונה 8. מאז העיקרי תאים בכבד תרבותי נעשה שימוש נרחב לבחון עיבוד מטבולית, תפקוד הורמונלי, מטבוליזם התרופה ורעילות כמו גם חסינות ותגובות דלקתיות 9, 10. פרוטוקולים הקודם בעיקר תארו את הבידוד האנזימטית של hepatocytes העיקרי מרקמות כבדות אנושי 11, 12. בעוד מודל מצוין, זה משמיט את היכולת ללמוד כיצד מניפולציה גנטית משפיע מנגנוני איתות כבדה מורכבים כמו גם השלכות תפקודיות על סוגים של גירויים שונים. בחלק הבא, אנו מתארים את הבידוד של hepatocytes העיקרי murine. יש לציין, כי השפעת מספר מתווכים של התגובה חריפה פאזיים בכבד, כגון lipopolysaccharide (LPS), IL-6 ו- FGF23 ניתן לנתח באופן קל, מהיר לשחזור 13.
בזאת, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד האנזימטית של hepatocytes מעכברים בוגרים, ואנחנו מראים כי מעוררים הוקמו של דלקת, כגון LPS ו- IL-6, כמו גם מתווכים דלקתיים רומן כגון FGF23, יכול ישירות לעורר ביטוי הפרשה ציטוקינים דלקתיים, כגון CRP ו- IL-6 ב hepatocytes תרבותי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בידוד hepatocytes העיקרי מעכברים הוא כלי מהיר, זול ואמין ללמוד תגובות דלקתיות vivo לשעבר. אם מבוצע כהלכה, יכול להיווצר תוצאות בקלות לשכפל מבעוד מועד וחסכוניים. הנקודות הבאות יש לבחון בזהירות כדי להבטיח בידוד מוצלח.
החתך כירורגית וא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH (R01HL128714 כדי CF) ו- (F31DK10236101 כדי KS) ואת איגוד הלב האמריקני (CF ו AG).
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
