マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導
Summary
ここでは、成体マウスからの初代肝細胞を単離するための酵素的アプローチを示し、我々は、ELISAおよびリアルタイムPCRを使用して炎症反応の定量化を記載します。
Abstract
肝臓は、全身性炎症の調節において決定的な役割を果たしています。特に慢性腎臓病では、肝臓は尿毒症環境、酸化ストレス、内毒素血症および急性期反応物質を大量に製造することにより炎症性サイトカインを循環させる減少クリアランスに応じて反応します。炎症や肝細胞の根本的な役割を研究するための実験的なツールは、特に、慢性腎臓病などの複雑な設定で、全身の急性期応答および長期の炎症誘発性シナリオに肝臓のサイトカインの調節および貢献を理解することが重要です。 生体内で炎症の複雑なメカニズムを研究することは困難なままであるため、通常はリソースを大量に消費するとは、トランスジェニック動物の使用を必要とし、第一の単離肝細胞は、肝臓の急性期反応に機構的洞察を得るための強力なツールを提供しています。このインビトロ技術は、中程度のコストを提供していますので、高い再生産性および技術常識には、一次単離された肝細胞はまた、容易にスクリーニング手法として使用することができます。ここでは、初代マウス肝細胞を単離するために、酵素ベースの方法を記載し、そして我々は、ELISAおよび定量的リアルタイムPCRを用いて、これらの細胞における炎症反応の評価を記述する。
Introduction
慢性腎臓病（CKD）は、急性および慢性炎症1の状態として定義することができます。 CKDを有する患者において、phosphaturicホルモン線維芽細胞増殖因子23（FGF23）の血清レベルは、徐々に、血清リン酸塩のホメオスタシス2を維持するために上昇します。増加した血清FGF23レベルは独立して、血液透析治療3、4を始めている患者の間で心血管疾患の罹患率と死亡率に関連付けられています。さらに、いくつかの臨床研究が上昇FGF23レベルおよびC反応性タンパク質（CRP）、インターロイキン6（IL-6）および腫瘍壊死因子α（TNFα）5、6の血清レベルの間に強い相関関係を示しています。また、実験的研究では、我々は、FGF23直接肝細胞を標的とし、CRPおよびIL-6 Pを増加させることにより炎症反応を引き起こすことができることが最近実証されています肝臓7でroduction。したがって、FGF23は、CKDにおける全身性炎症に貢献する循環因子として作用することがあります。
70年代初めには、初代肝細胞を単離し、初めて8のために勉強しました。それ以来、初代培養肝細胞が広範囲に代謝処理、ホルモン機能、薬物代謝および毒性を調べるだけでなく、免疫および炎症反応9、10に使用されてきました。以前のプロトコルは、主に、ヒト肝組織11、12からの一次肝細胞の酵素の単離を記載しています。優れたモデルが、これは複雑な肝臓のシグナル伝達機構と同様に刺激の異なる種類に応じて機能的結果にどのように影響するかを遺伝子操作研究する能力を残します。以下では、我々は、マウス初代肝細胞の単離を記載しています。注目すべきことに、このようなリポ多糖（LPS）、IL-6及びFGF23などの肝臓の急性期反応のいくつかのメディエーターの効果は、簡単、迅速かつ再現可能な方法13で解析することができます。
ここで、我々は、成体マウスからの肝細胞の酵素を単離するためのプロトコルを提示し、我々はそのようなLPSおよびIL-6などの炎症の確立された誘導物質、ならびにFGF23としての新規炎症性メディエーターは、直接の発現および分泌を刺激することができることを実証していますこのような培養肝細胞におけるCRPおよびIL-6などの炎症性サイトカイン、。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウスからの初代肝細胞を分離することにより、ex vivoでの炎症反応を研究するために、高速、安価で信頼性の高いツールです。正しく実行した場合、結果は容易に生成され、タイムリーかつ費用効率的な方法で再生することができます。以下の点を慎重に成功した絶縁を確保するために評価されるべきです。
外科的切開とIVCのカニュレーションは、全身麻?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH（R01HL128714 CF）と（KSへF31DK10236101）とアメリカ心臓協会（CFとAG）によってサポートされていました。
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
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