La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones
Summary
Aquí, se muestra un enfoque enzimático para aislar hepatocitos primarios de ratones adultos, y se describe la cuantificación de una respuesta inflamatoria mediante ELISA y PCR en tiempo real.
Abstract
El hígado juega un papel decisivo en la regulación de la inflamación sistémica. En la enfermedad renal crónica, en particular, el hígado reacciona en respuesta al medio urémico, estrés oxidativo, endotoxemia y la disminución del aclaramiento de circulación de citocinas proinflamatorias mediante la producción de un gran número de reactivos de fase aguda. herramientas experimentales para el estudio de la inflamación y el papel fundamental de los hepatocitos son cruciales para comprender la regulación y la contribución de citocinas hepáticas a una respuesta de fase aguda sistémica y un escenario pro-inflamatoria prolongada, especialmente en un entorno complejo como la enfermedad renal crónica. Desde el estudio de complejos mecanismos de la inflamación in vivo sigue siendo un reto, uso intensivo de recursos y por lo general requiere el uso de animales transgénicos, hepatocitos aislados primarios proporcionan una herramienta robusta para obtener información mecanicista en la respuesta de fase aguda hepática. Dado que esta técnica in vitro cuenta con costes moderados, alta reproducibilidad y el conocimiento técnico común, hepatocitos aislados primarios también se pueden utilizar fácilmente como un criterio de selección. A continuación, describimos un método basado en enzimática para aislar hepatocitos murinos primarios, y se describe la evaluación de una respuesta inflamatoria en estas células utilizando ELISA y cuantitativa en tiempo real PCR.
Introduction
La enfermedad renal crónica (ERC) se puede definir como un estado de inflamación aguda y crónica 1. En los pacientes con enfermedad renal crónica, los niveles séricos del factor de crecimiento de fibroblastos hormona fosfatúrica 23 (FGF23) aumentan progresivamente con el fin de mantener la homeostasis del fosfato sérico 2. Aumento de los niveles de FGF23 en suero se asocian de forma independiente con la morbilidad y la mortalidad cardiovascular en los pacientes que inician el tratamiento de hemodiálisis 3, 4. Además, varios estudios clínicos han demostrado una fuerte correlación entre los niveles de FGF23 elevadas y los niveles séricos de proteína C-reactiva (CRP), la interleucina-6 (IL-6) y factor de necrosis tumoral α (TNF) 5, 6. Por otra parte, en un estudio experimental, se ha demostrado recientemente que FGF23 puede dirigirse directamente a los hepatocitos y causar una respuesta inflamatoria mediante el aumento de la PCR y la IL-6 producción en el hígado 7. Por lo tanto, FGF23 podría actuar como un factor circulante que contribuye a la inflamación sistémica en la ERC.
A principios de los 70, los hepatocitos primarios fueron aislados y estudiados por primera vez 8. Desde entonces las células hepáticas de cultivo primario se han utilizado ampliamente para examinar el procesamiento metabólico, la función hormonal, el metabolismo de fármacos y toxicidad, así como la inmunidad y respuestas inflamatorias 9, 10. Protocolos anteriores han descrito principalmente el aislamiento enzimático de hepatocitos primarios a partir de tejido de hígado humano 11, 12. Mientras que un modelo excelente, esto deja fuera la capacidad de estudiar cómo la manipulación genética afecta a los mecanismos de señalización hepática complejos, así como consecuencias funcionales sobre diferentes tipos de estímulos. En lo que sigue, se describe el aislamiento de hepatocitos primarios murinos. En particular, el efecto de varios mediadores de la respuesta de fase aguda hepática, tales como lipopolisacárido (LPS), IL-6 y FGF23 se puede analizar de una manera fácil, rápida y reproducible 13.
En este documento, se presenta un protocolo para el aislamiento enzimático de los hepatocitos de ratones adultos, y demostramos que inductores establecidos de la inflamación, tales como LPS e IL-6, así como los mediadores inflamatorios novedosos como FGF23, pueden estimular directamente la expresión y secreción de citoquinas inflamatorias, tales como la PCR y la IL-6 en hepatocitos cultivados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aislamiento de hepatocitos primarios de ratones es una herramienta rápida, de bajo costo y fiable para estudiar las respuestas inflamatorias ex vivo. Si se realiza correctamente, los resultados pueden ser fácilmente generados y reproducen de una manera oportuna y rentable. Los siguientes puntos deben ser cuidadosamente evaluados con el fin de garantizar un éxito en el aislamiento.
La incisión quirúrgica y la canulación de la vena cava inferior se deben realizar bajo anestesia …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01HL128714 a CF) y (F31DK10236101 a KS) y la American Heart Association (CF y AG).
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
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