تحريض استجابة التهابية في الثقافات الابتدائية الكبدية من الفئران
Summary
هنا، وتبين لنا نهجا الأنزيمية لعزل خلايا الكبد الأولية من الفئران الكبار، ونحن تصف الكمي لاستجابة التهابية باستخدام ELISA وفي الوقت الحقيقي PCR.
Abstract
الكبد يلعب دورا حاسما في تنظيم الالتهابات. في أمراض الكلى المزمنة على وجه الخصوص، حيث يتفاعل الكبد ردا على الوسط اليوريمي، الاكسدة، endotoxemia وإزالة انخفضت تعميم السيتوكينات proinflammatory من خلال إنتاج عدد كبير من المواد المتفاعلة في المرحلة الحادة. أدوات تجريبية لدراسة التهاب والدور الأساسي لخلايا الكبد هي أساسية لفهم التنظيم ومساهمة السيتوكينات الكبد إلى مرحلة الاستجابة الحادة النظامية وسيناريو لفترات طويلة الموالية للالتهابات، وخصوصا في بيئة معقدة مثل مرض الكلى المزمن. منذ دراسة آليات معقدة من التهاب في الجسم الحي لا تزال صعبة، والموارد كثيفة، وعادة ما يتطلب استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا، وتقدم خلايا الكبد معزولة الأولية أداة قوية لاكتساب رؤى الآلية في الاستجابة المرحلة الحادة الكبدية. لأن هذا في المختبر تقنية ملامح التكاليف المعتدلة، وإعادة عاليةالطاقة الانتاجية والمعرفة التقنية المشتركة، يمكن للخلايا الكبد معزولة الأولية أن تستخدم أيضا بسهولة كنهج الفرز. هنا، نحن تصف طريقة القائم على الأنزيمية لعزل خلايا الكبد الفئران الأولية، وصفنا تقييم استجابة التهابية في هذه الخلايا باستخدام ELISA والكمي في الوقت الحقيقي PCR.
Introduction
مرض الكلى المزمن (CKD) يمكن تعريفها بأنها حالة من الالتهاب الحاد والمزمن 1. في المرضى الذين يعانون من كد، ومستويات المصل من هرمون الليفية عامل النمو phosphaturic 23 (FGF23) يرتفع تدريجيا من أجل الحفاظ على الفوسفات في الدم التوازن 2. وترتبط زيادة مستويات FGF23 المصل بشكل مستقل مع معدلات الاعتلال والوفيات القلب والأوعية الدموية لدى المرضى الذين بدأوا العلاج غسيل الكلى 3، 4. وعلاوة على ذلك، أظهرت العديد من الدراسات السريرية وجود علاقة قوية بين مستويات FGF23 مرتفعة ومستويات مصل البروتين سي التفاعلي (CRP)، انترلوكين 6 (IL-6) وورم α عامل نخر (TNFα) 5، 6. وعلاوة على ذلك، في دراسة تجريبية، قمنا في الآونة الأخيرة أظهرت أن FGF23 يمكن أن تستهدف مباشرة خلايا الكبد ويسبب استجابة التهابية من خلال زيادة البروتين وIL-6 صرودوكشن في الكبد 7. وبالتالي، FGF23 قد يكون بمثابة عامل المتداولة التي تساهم في التهاب النظامية في CKD.
في 70 في وقت مبكر، وكانت خلايا الكبد الأولية معزولة ودرس لأول مرة 8. ومنذ ذلك الحين استخدمت خلايا الكبد مثقف الابتدائي على نطاق واسع لدراسة معالجة الأيض، وظيفة الهرمونية، استقلاب الدواء وسمية وكذلك الحصانة والاستجابات الالتهابية 9 و 10. ووصف البروتوكولات السابقة أساسا العزلة الأنزيمية من خلايا الكبد الأولية من أنسجة الكبد البشري 11 و 12. بينما نموذجا ممتازا، وهذا يترك من القدرة على دراسة كيفية التلاعب الجيني يؤثر على آليات إشارات الكبد معقدة وكذلك العواقب الوظيفية على أنواع مختلفة من المحفزات. في ما يلي، وصفنا عزل خلايا الكبد الأولية الفئران. والجدير بالذكر، يمكن تحليل تأثير عدة وسطاء للاستجابة في المرحلة الحادة الكبدية، مثل lipopolysaccharide في (LPS)، IL-6 و FGF23 في وسيلة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار بطريقة 13.
هنا، نقدم بروتوكول لعزل الأنزيمية من خلايا الكبد من فئران بالغة، وعلينا أن نبرهن على المحرضات التي أنشئت من التهاب، مثل LPS وIL-6، وكذلك وسطاء التهابات جديدة مثل FGF23، يمكن أن تحفز مباشرة التعبير وإفراز السيتوكينات الالتهابية، مثل البروتين وIL-6 في خلايا الكبد مثقف.
Protocol
Representative Results
Discussion
عزل خلايا الكبد الأولية من الفئران هو أداة سريعة وغير مكلفة ويمكن الاعتماد عليها لدراسة الاستجابات الالتهابية خارج الحي. إذا أجريت بشكل صحيح، النتائج التي يمكن أن تتولد بسهولة ومستنسخة في الوقت المناسب وبطريقة فعالة من حيث التكلفة. وينبغي تقييم النقاط التالية …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01HL128714 إلى CF) و (F31DK10236101 إلى KS)، وجمعية القلب الأمريكية (قوات التحالف وAG).
Materials
| Consumables | |||
| Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
| 100 6-inch Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style | Corning | 353003 | |
| 6 well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| 5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) | LOOK | SP115 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Perfusion Pump | Gilson | F155007 | |
| Hemacytometer Kits, Propper | VWR | 48300-474 | |
| Hemacytometer Cover Glasses, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Surgical Scissers – Sharp/Blunt | F.S.T. | 14001-12 | |
| Iris Scissors-ToughCut Straight | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Forceps | F.S.T. | 11203-25 | |
| Student Tissue Forceps | F.S.T. | 991121-12 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetic acid solution, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurane, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xylazine 100 mg/mL | AnaSed Injection | 139-236 | |
| Willams' Medium E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Liver Perfusion Medium (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Liver Digest Medium (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | Life Technologies | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | Life Technologies | CM4000 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Trypan Blue Solution | VWR | 45000-717 |
References
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
- Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
- Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
- Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
- Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885 (2015).
- Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
- Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
- Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
- Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
- Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).
