זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry
Summary
בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.
Abstract
מקרופאגים הם phagocytes מקצועי מזרוע מולדת של המערכת החיסונית. במצב יציב, מקרופאגים נינוחים נמצאים ברקמות מבוגר שבו הם פועלים כמו זקיפים קו הקדמי של זיהום נזק לרקמות. בעוד תאי חיסון אחרים מתחדשים ללא הרף מן גזע ההמטופויטים ותאי האב (HSPC) הממוקמים במח העצם, השושלת של מקרופאגים, הידועה כמקרופאגים מקומיים, הוכחה כמתוחזקת בעצמה ברקמות ללא קלט ממחלת HSPCs של מח עצם. השושלת הזו מודגמת על ידי מיקרוגליה במוח, תאי קופפר בכבד ובתאי לנגרהנס באפידרמיס. המעי הגס ומעי הגס lamina propria הם רק רקמות מבוגר ללא מקרופאגים תושב עצמאי HSPC. מחקרים שנערכו לאחרונה זיהו כי מקרופאגים תושב שמקורם hematopoiesis חלמון עובריים מחוץ עובריים (מ) נבדל תאי גזע עובריים hematopoietic (HSC). בין heletopoiesis שק החלמון סופי, eאבות rythromyeloid (EMP) לעורר הן erythroid תאים מיאלואידים, מקרופאגים תושב בפרט. EMP נוצרים רק בתוך שק החלמון בין E8.5 ו E10.5 ימים של פיתוח והם נודדים לכבד העובר כבר בתחילת המחזור, שם הם מתרחבים ומבדילים עד לפחות E16.5. צאצאיהם כוללים אריתרוציטים, מקרופאגים, נויטרופילים ותאי תורן, אך רק מקרופאגים שמקורם ב- EMP נמשכים עד לבגרות ברקמות. אופי חולף של הופעת EMP ואת חפיפה הזמני עם הדור HSC הופך ניתוח של אבות אלה קשה. הקמנו טמוקסיפן- inducible מיפוי פרוטוקול מיפוי מבוסס על ביטוי של מקרופא ציטוקין קולטן Csf1r האמרגן לאפיין EMP ו EMP הנגזרות תאים in vivo על ידי cytometry הזרימה.
Introduction
ישנם מספר גלים רצופים אך חופפים של אבות hematopoietic במהלך התפתחות הצאצאים myeloid להישאר בבגרות. ראשית, אבות "פרימיטיביים" יוצאי דופן מופיעים בשק החלמון העכבר 1 , 2 בין E7.5-E8.25 ו להוליד מקרופאגים עובריים ללא כל ביניים monocytic. אם מקרופאגים נגזר אבות פרימיטיביים להתמיד במוח המבוגר כמו microglia נשאר נושא של חקירה פעילה. שנית, Erythro-Myeloid מבשרי (EMPs) להתעורר בשק החלמון ב E8.5, להיכנס למחזור הדם ליישב את העובר. EMPs לצאת מתוך האנדותל hemogenic שק חלמון במעבר האנדותל ל- hematopoietic Runx1 תלויי 3 , 4 . בעוד EMP יכול להבדיל לתוך מקרופאגים בתוך שק החלמון, הם גם ליישב את הכבד עוברית מיום עובריים (E) 9 5 ו differentenTiate לתוך erythrocytes, megakaryocytes, מקרופאגים, מונוציטים גרנולוציטים ותאי התורן 6 . מקרופאגים הנובעים EMPs התערוכה קיבולת השגשוג ברקמות התפתחותיות ומבוגרים. אם מקרופאגים נגזרות EMP לעקוף את השלב מונוציטים של בידול עדיין שנוי במחלוקת כמו מעט מאוד ידוע על מסלול ההבחנה שלהם 7 , 8 . לבסוף, תאים גזעיים ההמטופויטים (HSCs) מופיעים ב E10.5 בתוך העובר הנכון מאזור אבי העורקים- gonad-mesonephros ו נודדים לכבד העובר. HSCs עם יכולת repopulation לטווח ארוך מזוהים רק לאחר E11 (על הבמה זוג 42 somite) 9 . שם הם מתפשטים ומבדילים בין E12.5 עד שהמטופויזיס המוחלט מתחיל לעבור למוח העצם, אשר הופך להיות האתר השולט של ייצור תאי הדם למשך החיים שלאחר הלידה 10 .
את spAtial ו חפיפה זמנית בהופעתה, כמו גם סמנים immuno-phenotypic משותף יש עד כה הפריע ביכולתנו להבחין התרומות הספציפיות של גלים אלה של אבות hematopoietic עובריים. בעוד ששניהם EMP ו- HSC נוצרים באופן תלוי ב- Runx1 ומבטאים את גורם התעתוק Myb ואת מקדם גדילה Csf1r (קולוני-מגרה פקטור 1 קולטן, הידוע גם בשם מקרופאג קולוני מגרה פקטור קולטן) בין היתר, EMPs ניתן להבחין HSCs על ידי היעדר הפוטנציאל הלימפה, הן במבחנה והן in vivo , חוסר שלהם לטווח ארוך repopulating פוטנציאל וחוסר ביטוי פני השטח של השושלת סמן Sca-1 11 . מודלים מיפוי גורל גנטי נדרשים לאפיין ontogenny מקרופאג שכן הם מאפשרים מיקוד אבות עובריים באופן ספציפי תא ספציפי זמן. כאן אנו מציגים את פרוטוקול מיפוי הגורל המשמש במעבדה שלנו כדי להפלות בין שני השושלתS של מקרופאגים נמצא רוב הרקמות למבוגרים: HSC הנגזר מקרופאגים מקרופאגים תושב עצמאי HSC.
מקרופאגים תושב רקמות כבר נעוצים תאים מבשר מייב עצמאית להביע את הקולטן ציטוקינים Csf1r 12 ו נמצאים העובר ב E8.5-E10.5 באמצעות שלוש משלימות גורל מיפוי אסטרטגיות 6 . כדי ללמוד hematopoiesis שקית חלמון ללא תיוג HSCs עוברי, אנו משתמשים זן מהונדס, Csf1r MeriCreMer , להביע חלבון היתוך טמוקסיפן- inducible של recombinase "משופר" Cre ושני קולטנים אסטרוגן העכבר (Mer-iCre-Mer) תחת שליטה של את Csf1r האמרגן. לפיכך, recombinase Cre יהיה פעיל בתאים Csf1r -expressing במהלך חלון זמן מוגבל. כאשר נעשה שימוש עם זן כתב המכיל חלבון פלואורסצנטי במורד של קוקס lox-stox-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), זה יוביל את הקבועתיוג גנטי של התאים הנוכחים בזמן אינדוקציה, אלא גם של צאצאיהם. מינהל ב- E8.5 של הצורה הפעילה של טמוקסיפן, 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), תוויות EMPs ומקרופאגים, ללא תיוג של חלמון שן "אבות פרימיטיביים" חסרי אונים או HSCs עוברית. בכך, יש לנו אפיינו את אימונופנוטיפ של EMPs וצאצאיהם במהלך ההתפתחות העוברית, כמו גם להעריך את תרומתו של מקרופאגים שק חלץ נגזר לבריכות macrophage מבוגר. עבודה נוספת נדרשת לאפיין אם מקרופאגים נגזרים פרימיטיביים אב מתויגים גם באמצעות גישה זו והאם הם יכולים לתרום בריכות מקרופאג מבוגר.
Protocol
Representative Results
Discussion
גלים שונים של תאים מבשר hematopoietic חלקית חופפים בתוך מסגרת זמן קצר, מה שהופך את הניתוח של התרומה של כל גל של hematopoiesis התפתחותי לתאי החיסון מבחינה טכנית מאתגר מאוד.
טמוקסיפן- inucible Cre מערכות להציע את ההזדמנות כדי לתג תאים ספציפיים באופן ז…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לפרופ 'פרדריק גיסמן ופרופ' כריסטיאן שולץ על דיונים מעמיקים; ד"ר חנה גארנר לקריאה ביקורתית של כתב היד, ד"ר חאווייר מונטגוטלי וד"ר ז'אן ג'וברט ואנשי מכון החיות Institut Pasteur לתמיכה בבני אדם; ו Pascal Dardenne ו Vytaute Boreikaite, Amgen Scholar, על סיוע טכני שלהם. המחקר במעבדה EGP ממומן על ידי Institut Pasteur, CNRS, ה- Cercle FSER (FRM וחבילת פתיחה של Institut Pasteur וקונסורציום REVIVE. LI נתמך על ידי מלגת דוקטורט מקונסורציום REVIVE.
Materials
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero, ., E, , et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
