Идентификация эритромиелоидных прародителей и их потомство в мышечном эмбрионе методом проточной цитометрии
Summary
В то время как инфильтрирующие макрофаги непрерывно набираются во взрослые ткани из циркулирующих предшественников, резидентные макрофаги засевают свою ткань во время развития, где они поддерживаются без дальнейшего введения от предшественников. Недавно были определены прародители для резидентных макрофагов. Здесь мы представляем методы картирования генетической судьбы резидентных предшественников макрофагов.
Abstract
Макрофаги являются профессиональными фагоцитами из врожденного плеча иммунной системы. В стационарных, сидячих макрофагах встречаются во взрослой ткани, где они выступают в качестве фронтальных часовых инфекций и повреждения тканей. В то время как другие иммунные клетки постоянно обновляются из гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC), расположенных в костном мозге, показано, что линия макрофагов, известных как резидентные макрофаги, сохраняется в тканях без введения HSPC из костного мозга. Эта линия представлена микроглиями в мозге, клетками Купфера в печени и клетками Лангерганса в эпидермисе среди других. Протеины кишечника и толстой кишки являются единственными взрослыми тканями, лишенными HSPC-независимыми резидентными макрофагами. Недавние исследования выявили, что резидентные макрофаги происходят от гемопоэза экстра-эмбрионального желточного мешка от предшественника (-ов), отличного от эмбриональных гемопоэтических стволовых клеток (HSC). Среди желчного мешка окончательный гемопоэз, eRythromyeloid progenitors (EMP) вызывают как эритроидные, так и миелоидные клетки, в частности резидентные макрофаги. EMP генерируются только в желчном мешке между E8.5 и E10.5 дней развития, и они мигрируют в фетальную печень уже в процессе циркуляции, где они расширяются и дифференцируются, по крайней мере, до E16.5. Их потомство включает эритроциты, макрофаги, нейтрофилы и тучные клетки, но только макрофаги, полученные из EMP, сохраняются до взрослого состояния в тканях. Временная природа возникновения ЭМП и временное перекрытие с генерацией HSC затрудняют анализ этих предшественников. Мы установили протокол картирования тамоксифен-индуцибельной судьбы, основанный на экспрессии промотора Csf1r рецептора макрофагов цитокинов, чтобы охарактеризовать клетки EMP и EMP in vivo с помощью проточной цитометрии.
Introduction
Есть несколько последовательных, но перекрывающихся волн гемопоэтических предшественников во время развития, чье миелоидное потомство остается во взрослой жизни. Во-первых, унипотентные «примитивные» предшественники появляются в мешке желтка мыши 1 , 2 между E7.5-E8.25 и вызывают эмбриональные макрофаги без какого-либо моноцитарного промежуточного соединения. Являются ли макрофаги, полученные из примитивных предшественников, сохраняющимися во взрослом мозге, поскольку микроглия остается объектом активного исследования. Во-вторых, эритро-миелоидные прекурсоры (ЭМП) возникают в желчном мешке на E8.5, попадают в кровоток и колонизируют эмбрион. EMP выходят из эндогенного желчного мешка эндометрия в белково-зависимом эндотелиаль-гемопоэтических переходах 3 , 4 . Хотя EMP может дифференцироваться в макрофаги в желчном мешке, они также колонизируют фетальную печень из эмбрионального дня (E) 9 5 и дифференцируютВ эритроциты, мегакариоциты, макрофаги, моноциты гранулоцитов и тучных клеток 6 . Макрофаги, происходящие от ЭМП, проявляют пролиферативную способность в тканях развития и взрослых. Независимо от того, что макрофаги, полученные из EMP, обходят моноцитарную стадию дифференциации, все еще противоречивы, поскольку очень мало известно об их пути дифференциации 7 , 8 . Наконец, гематопоэтические стволовые клетки (HSCs) появляются на E10.5 внутри собственно эмбриона из области аорта-гонад-мезонефроса и мигрируют в фетальную печень. HSC с долговременной репопуляционной способностью обнаруживаются только после E11 (на стадии 42 сомитовой пары) 9 . Там они расширяются и отличаются от E12.5 до тех пор, пока окончательный гематопоэз не начнет переходить в костный мозг, который становится преобладающим местом производства клеток крови в течение постнатальной жизни 10 .
SpА также общие иммунофенотипические маркеры до сих пор мешали нашей способности различать специфический вклад этих волн эмбриональных гемопоэтических предшественников. В то время как как EMP, так и HSC генерируются в зависимом от Runx1 образом и экспрессируют транскрипционный фактор Myb и рецептор фактора роста Csf1r (Colon-Stimulating Factor 1 Receptor, также известный как Macrofage Colony Stimulating Factor Receptor), среди прочих, EMP можно отличить от HSC по их отсутствию лимфоидного потенциала, как in vitro, так и in vivo , отсутствие долговременного потенциала репопуляции и отсутствие поверхностной экспрессии маркера линии Sca-1 11 . Генетические модели картирования судьбы необходимы для характеристики онтогенеза макрофагов, поскольку они позволяют нацеливать эмбриональных предшественников на специфические для клеток и специфичные по времени. Здесь мы представляем протокол сопоставления судьбы, используемый в нашей лаборатории, для различения двух линийС макрофагами, обнаруженными в большинстве взрослых тканей: HSC-производные инфильтрирующие макрофаги и HSC-независимые резидентные макрофаги.
Живые макрофаги тканей были прослежены до Myb-независимых клеток-предшественников, экспрессирующих цитокиновый рецептор Csf1r 12 и присутствующих в эмбрионе на E8.5-E10.5 с использованием трех дополнительных стратегий картирования судьбы 6 . Для изучения гептапоэза желточного мешка без маркировки эмбриональных HSCs мы используем трансгенный штамм Csf1r MeriCreMer , экспрессирующий индуцируемый тамоксифеном слитый белок «улучшенной» рекомбиназы Cre и двух рецепторов эстрогена мыши (Mer-iCre-Mer) под контролем Промотор Csf1r. Следовательно, рекомбиназа Cre будет активна в Csf1r-экспрессирующих клетках в течение ограниченного временного окна. При использовании с репортерным штаммом, содержащим флуоресцентный белок ниже кассеты lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), это приведет к постоянномуГенетической маркировки клеток, присутствующих во время индукции, но также и их потомства. Введение в E8.5 активной формы тамоксифена, 4-гидрокситамоксифена (OH-TAM), метки EMP и макрофагов, без маркировки желточных мешочков, унипотентных «примитивных» предшественников или эмбриональных HSC. Таким образом, мы характеризовали иммунофенотип ЭМП и их потомство во время эмбрионального развития, а также оценивали вклад макрофагов, полученных из желточного мешка, в взрослые бассейны макрофагов. Требуется дальнейшая работа, чтобы охарактеризовать, можно ли маркировать макрофаги примитивных предшественников, используя этот подход, и могут ли они вносить вклад в пулы взрослых макрофагов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Различные волны гемопоэтических клеток-предшественников частично перекрываются в течение короткого периода времени, что делает анализ вклада каждой волны гематопоэза развития в иммунные клетки технически очень сложным.
Системы, индуцируемые тамоксифеном Cre, предлаг?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят профессора Фредерика Гейссмана и профессора Кристиана Шульца за проницательные дискуссии; Д-р Ханна Гарнер за критическое чтение рукописи, д-ра Ксавьера Монтагутелли и д-ра Жана Жюберта и сотрудников животного объекта Institut Pasteur для поддержки с мышами; И Паскаль Дарденн и Вытаут Борейкайте, научный сотрудник Amgen, за их техническую помощь. Исследования в лаборатории EGP финансируются Институтом Пастера, CNRS, Cercle FSER (FRM) и стартовым пакетом от Institut Pasteur и консорциума REVIVE. LI поддерживается стипендией PhD от консорциума REVIVE.
Materials
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero, ., E, , et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
