Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry
Summary
Terwijl infiltrerende macrofagen continu worden aangeworven op volwassen weefsels uit circulerende precursoren, zitten inwendige macrofagen hun weefsel tijdens ontwikkeling, waar ze worden gehandhaafd zonder verdere input van stamvaders. De voorlopers voor ingezette macrofagen werden recent geïdentificeerd. Hier presenteren wij methoden voor de genetische lotvorming van de ingezeten makrofage stamvaders.
Abstract
Macrofagen zijn professionele fagocyten uit de aangeboren arm van het immuunsysteem. In stabiele toestand worden sessiele macrofagen gevonden in volwassen weefsels waar ze fungeren als frontlinks van infectie en weefselschade. Terwijl andere immuuncellen voortdurend worden vernieuwd van hematopoietische stam- en stamcellen (HSPC) in het beenmerg, is een reeks macrofagen, bekend als inwendige macrofagen, aangetoond dat ze zelfstandig in weefsels zijn gehandhaafd zonder input van beenmerg HSPC's. Deze lijn wordt geïllustreerd door microglia in de hersenen, Kupffer cellen in de lever en Langerhans cellen in de epidermis onder anderen. De darm- en colon lamina propria zijn de enige volwassen weefsels zonder HSPC-onafhankelijke inwendige macrofagen. Recente onderzoeken hebben aangetoond dat inwendige macrofagen afkomstig zijn van de extra-embryonale dooierzak hematopoiesis van stamvader (e) die onderscheiden zijn van foetale hematopoietische stamcellen (HSC). Onder de dooierzak definitieve hematopoiesis, eRythromyeloïde stamvogens (EMP) veroorzaken zowel erythroid en myeloïde cellen, in het bijzonder inwendige macrofagen. EMP worden alleen gegenereerd binnen de dooierzak tussen de E8.5 en E10.5 dagen van ontwikkeling en ze migreren naar de foetale lever zodra de circulatie is verbonden, waar ze zich uitbreiden tot en met elkaar onderscheiden tot minstens E16.5. Hun nakomelingen omvatten erythrocyten, macrofagen, neutrofielen en mastcellen, maar alleen EMP-afgeleide macrofagen blijven tot volwassenheid in weefsels. De transiënte aard van EMP-opkomst en de tijdelijke overlap met HSC-generatie maakt de analyse van deze voorgangers moeilijk. We hebben een tamoxifen-induceerbaar loting protocol op basis van expressie van de macrofage cytokine receptor Csf1r promotor vastgesteld om EMP en afgeleide cellen in vivo door flowcytometrie te karakteriseren.
Introduction
Er zijn verscheidene opeenvolgende maar overlappende golven van hematopoietische voorlopers tijdens de ontwikkeling waarvan de myeloïde nakomelingen in de volwassenheid blijven. Ten eerste komen unipotente "primitieve" stamvaders op in de muisbloemzak 1 , 2 tussen E7.5-E8.25 en geven aanleiding tot embryonale macrofagen zonder enig monocytisch intermediair. Of macrofagen afgeleid van primitieve stamvaders volharden in de volwassen hersenen, aangezien microglia een onderwerp blijft van actief onderzoek. Ten tweede ontstaan er erythro-myeloïde precursoren (EMP's) in de dooierzak op E8.5, de bloedbaan binnendringen en het embryo coloniseren. EMP's komen uit het geelogenische endothelium van de dooier in een Runx1-afhankelijke endotheel-naar-hematopoietische overgang 3 , 4 . Terwijl EMP kan onderscheiden in macrofagen binnen de dooierzak, koloniseren ze ook de foetale lever vanaf de embryonale dag (E) 9 5 en verschillenTiëren in erythrocyten, megakaryocyten, macrofagen, monocyten granulocyten en mastcellen 6 . De macrofagen die afkomstig zijn van EMP's vertoont proliferatieve capaciteit in ontwikkelings- en volwassen weefsels. Of EMP-afgeleide macrofagen het monocyt-stadium van differentiatie omzeilen, is nog steeds controversieel omdat er weinig bekend is over hun differentieringsroute 7 , 8 . Tenslotte verschijnen hematopoietische stamcellen (HSC's) op E10.5 binnen het embryo dat goed is van het aorta-gonad-mesonephros-gebied en migreert naar de foetale lever. HSC's met langetermijnreplopatiecapaciteit worden pas na E11 gedetecteerd (bij de 42 somite pair-fase) 9 . Daar worden ze uitgebreid en onderscheiden van E12.5 tot definitieve hematopoiesis begint te verschuiven naar het beenmerg, dat de overheersende plaats van bloedcelproductie wordt voor de duur van het postnatale leven 10 .
De spAtiale en temporele overlap in opkomst, evenals gedeelde immunofenotypische markers heeft tot dusver ons vermogen om de specifieke bijdragen van deze golven van embryonale hematopoietische stamvogens te onderscheiden, verholpen. Terwijl zowel EMP als HSC op een Runx1-afhankelijke manier worden gegenereerd en de transcriptiefactor Myb en de groeifactorreceptor Csf1r (Colony-Stimulerende Factor 1 Receptor, ook wel Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor) onder andere, uiten, kunnen EMP's onderscheiden worden van HSC's door hun gebrek aan lymfoïde potentieel, zowel in vitro als in vivo , hun gebrek aan langdurig repopulatiepotentieel en gebrek aan oppervlakte-expressie van de afstamingsmarkering Sca- 11 . Genetische kaartvormingsmodellen zijn nodig om macrofage ontogenie te karakteriseren, omdat ze op een celspecifieke en tijdspecifieke manier gericht zijn op embryonale voorlopers. Hier presenteren we het protocol in het laboratorium dat in ons laboratorium wordt gebruikt om tussen de twee lijn te onderscheidenS van macrofagen gevonden in de meeste volwassen weefsels: HSC-afgeleide infiltrerende macrofagen en HSC-onafhankelijke inwendige macrofagen.
Weefsel-ingezette macrofagen zijn teruggevonden naar Myb-onafhankelijke precursorcellen die de cytokine-receptor Csf1r 12 uitdrukken en aanwezig zijn in het embryo bij E8.5-E10.5 met behulp van drie complementaire strategieën voor schematische strategieën 6 . Om de bloedsomloop hematopoiesis te bestuderen zonder het labelen van foetale HSC's, gebruiken we een transgene stam, Csf1r MeriCreMer , die een tamoxifen-induceerbaar fusie-eiwit uitmaakt van 'verbeterde Cre-recombinase en twee muis-oestrogeenreceptoren (Mer-iCre-Mer) onder controle van De Csf1r promotor. Derhalve zal het Cre recombinase actief zijn in Csf1r-expressieve cellen tijdens een beperkt tijdvenster. Wanneer het wordt gebruikt met een reporterstam die een fluorescerend eiwit bevat stroomafwaarts van een lox-STOP-lox cassette (Rosa26 LSL-eYFP ), zal het leiden tot de permanenteGenetische labeling van de cellen die aanwezig zijn op het moment van inductie maar ook van hun nakomelingen. Toediening bij E8.5 van de actieve vorm van tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), etiketten EMP's en macrofagen, zonder etikettering van dooierzak unipotente "primitieve" stamvogens of foetale HSC's. Daarbij hebben we het immuunfenotype van EMP's en hun nakomelingen tijdens embryonale ontwikkeling gekenmerkt, evenals de bijdrage van geel-afkomstige macrofagen aan de volwassen macrofagepoolen beoordeeld. Verdere werkzaamheden zijn nodig om te karakteriseren of primitieve stamvader-afgeleide macrofagen ook met deze aanpak worden gemerkt en of ze kunnen bijdragen aan volwassen macrofagepoolen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De verschillende golven van hematopoietische precursorcellen overlappen gedeeltelijk over een kort tijdsbestek, waardoor de analyse van de bijdrage van elke golf van ontwikkelingshematopoiesis aan immuuncellen technisch zeer uitdagend is.
Tamoxifen-induceerbare Cre-systemen bieden de mogelijkheid om specifieke cellen op een temporele induceerbare manier te merken en lijnanalyse uit te voeren in embryo's of volwassenen, zonder de noodzaak van ex vivo of in vitro- cultuur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken prof Frederic Geissmann en prof Christian Schulz voor inzichtige discussies; Dr Hannah Garner voor kritisch lezen van het manuscript, Dr Xavier Montagutelli en Dr Jean Jaubert en het personeel van de Institut Pasteur-dierfaciliteit ter ondersteuning van de veeteelt; En Pascal Dardenne en Vytaute Boreikaite, een Amgen Scholar, voor hun technische bijstand. Onderzoek in het EGP-laboratorium wordt gefinancierd door de Institut Pasteur, de CNRS, de Cercle FSER (FRM en een startpakket van het Institut Pasteur en het REVIVE-consortium. LI wordt ondersteund door een PhD-genootschap van het REVIVE-consortium.
Materials
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 dilution in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Special care should be taken when preparing and working with tamoxifen and its derivates. Always use appropriate personal protective equipment |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Always use appropriate personal protective equipment |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Always use appropriate personal protective equipment and use under the fumehood |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2×5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero, ., E, , et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
