Summary

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolha, criopreservação e heterólogo fertilização In Vitro

Published: August 21, 2017
doi:

Summary

Aqui, apresentamos os protocolos que foram usados com sucesso para a coleta de espermatozoides de golfinho, criopreservação e desempenho de fertilização in vitro heterólogo usando oócitos bovinos.

Abstract

O uso de espermatozoides criopreservados golfinho facilita a troca de material genético entre parques aquáticos e torna espermatozoides acessível aos laboratórios para estudos aprofundar nossa compreensão da reprodução de mamíferos marinhos. Fertilização in vitro heterólogo, um substituto para fertilização in vitro homólogo, poderia fornecer um meio para testar a fertilidade do esperma potencial; para estudar a fisiologia de gametas e desenvolvimento precoce do embrião; e para evitar o uso de oócitos valioso golfinho, que são difíceis de obter. Aqui, apresentamos os protocolos que têm sido utilizados com sucesso para recolher e cryopreserve espermatozoides de golfinho. A colheita de sémen é executada pela estimulação manual sobre golfinhos treinados. Criopreservação é realizada usando um extensor de gema de ovo com base TRIS com glicerol. Além disso, apresentamos um protocolo que descreve a fertilização in vitro heterólogo usando espermatozoides golfinho e oócitos bovinos e que verifica a natureza híbrida do embrião resultante usando PCR. Fertilização heteróloga gera perguntas sobre fertilização e pode ser usada como uma ferramenta para estudar a fisiologia de gametas e desenvolvimento precoce do embrião. Além disso, o sucesso da fertilização in vitro heterólogo demonstra o potencial desta técnica para testar o esperma de golfinho fertilizando a capacidade, o que vale a pena o exame adicional.

Introduction

Tecnologias de reprodução assistida estão pouco desenvolvidas em animais selvagens, incluindo os mamíferos marinhos. A falta de métodos sensíveis para avaliar o sucesso de fertilização esperma contribui para o desenvolvimento de tecnologias de reprodução de espécies como o golfinho. Não era até recentemente que os parâmetros básicos seminais do golfinho-roaz (Tursiops truncatus) foram relatados1,2. No entanto, variáveis, tais como a motilidade e morfologia, embora amplamente utilizado, dar informações limitadas sobre a eficiência reprodutiva. O melhor indicador da qualidade do esperma é a avaliação do potencial de fertilização.

Recentemente, nosso grupo usou um método para avaliar esperma de golfinho fertilizando potencial, avaliando a formação pró-nuclear masculina e/ou formação de embrião híbrido depois da fertilização in vitro heteróloga usando oócitos bovinos intactos de zona3. O uso de fertilização in vitro heterólogo golfinho-bovinos tem vantagens importantes sobre fertilização in vitro homóloga, como ele supera a dificuldade de obtenção de oócitos de golfinho e facilita o uso do bem testado em vitro sistemas de maturação de ovócitos bovinos. Para evitar a especificidade da espécie, fecundação heteróloga é executada geralmente na ausência de ZP. Embora permite a avaliação da capacidade dos espermatozoides com acrossoma-reagiu se fundem com a membrana vitelínico, reduzes a avaliação de outras características relacionadas à fertilização. O procedimento descrito usa a zona de oócitos intacta e permite a avaliação dos seguintes parâmetros: vinculação de zona de esperma e fixação, penetração, poliespermia, formação pró-nuclear e clivagem de embriões híbridos.

Aqui, apresentamos vários protocolos para coleta de esperma, esperma básico análise, congelamento de espermatozoides, bem como a avaliação da funcionalidade do esperma de golfinho, avaliando a formação de embrião pró-nuclear e/ou híbrido masculina após a fertilização in vitro heteróloga usando zona intacta oócitos bovinos.

Protocol

declaração de ética: todos os procedimentos experimentais foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso do Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) e institucionais Cuidado Animal. Todos os experimentos foram realizados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, tal como adoptadas pela sociedade para o estudo da reprodução e para o Animal Welfare Act para cuidar dos mamíferos marinhos. 1. coleção de esperma de golfinh…

Representative Results

Todos os resultados, tabelas e figuras (1 e 2) aqui apresentadas foram reproduzidas com permissão3. Espermatozoides de golfinho tem alta mobilidade após congelação e descongelação A golfinho congelado-descongelar ejacula mostrou percentagens (% ± DP) de 84.5 ± 5,3 total motile e 69,1 ± 5,1 espermatozoides móveis progressivos. Em termos de…

Discussion

Para muitas espécies diferentes de mamíferos, existem diversas vantagens em usar o esperma congelado-descongelar. Estes incluem a capacidade de transferir material genético valioso, o potencial para distribuição em todo o mundo, o baixo risco de contaminação e a capacidade de preservar os gametas masculinos por décadas. O uso de espermatozoides criopreservados é essencial para o golfinho, porque esta espécie está protegida sob o apêndice II da CITES, que limita o transporte e o intercâmbio de animais entre d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

seu trabalho foi financiado pelo Ministério da economia e competitividade (AGL2015-70140-R a D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan e J. F. Pérez-Gutiérrez e Seneca Fundação de Murcia (Grant 20040/GERM/16 para F. García-Vázquez) espanhol

Materials

FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

References

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Cite This Article
Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

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