Summary

Spermatozoa דולפין (והוולדות truncatus) קצר: אוסף, הקפאה קריוגנית ו Heterologous הפריה

Published: August 21, 2017
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של שימשו בהצלחה עבור אוסף spermatozoa דולפין, הקפאה קריוגנית וביצועים heterologous IVF באמצעות oocytes שור.

Abstract

השימוש של דולפין cryopreserved spermatozoa מקל על חילופי חומר גנטי בין פארקים ימיים והופך spermatozoa נגיש למעבדות ללימודים לקדם את ההבנה שלנו של יונקים ימיים רבייה. Heterologous להפריה חוץ גופית, תחליף הומולוגי להפריה חוץ גופית, יכול לספק אמצעי כדי לבדוק הזרע פוריות אפשריות; ללמוד פיזיולוגיה תא רבייה והתפתחות העובר מוקדם; כדי למנוע את השימוש oocytes דולפין בעל ערך, אשר קשה להשיג. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של שימשו בהצלחה כדי לאסוף cryopreserve spermatozoa דולפין. איסוף זרע מתבצע על ידי גירוי ידני על דולפינים מיומן. הקפאה קריוגנית מושגת באמצעות הרחבה מבוסס חלמון ביצה של טריס גליצרול. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול זה מתאר heterologous חוץ-גופית בשיטת דולפין spermatozoa, oocytes שור ומוודא כי מהות היברידית וכתוצאה מכך העובר באמצעות PCR. הפריה heterologous מעלה שאלות על הפריה והוא יכול לשמש ככלי ללמוד פיזיולוגיה תא רבייה והתפתחות העובר מוקדם. בנוסף, ההצלחה של הפריה חוץ גופית heterologous מדגימה את הפוטנציאל של טכניקה זו כדי לבדוק הזרע דולפין הורס את ביצועיו, שווה בדיקה נוספת.

Introduction

בסיוע טכנולוגיות פריון הן מפותחות חיות בר, כולל יונקים ימיים. העדר רגיש שיטות להערכת ההצלחה המפרה זרע תורם להתפתחות איטית של טכנולוגיות פריון במינים כמו דולפין. זה לא היה עד לאחרונה כי הפרמטרים הבסיסיים החלוצי של דולפינן (והוולדות truncatus) היו שדווחה1,2. עם זאת, משתנים כגון תנועתיות, מורפולוגיה, למרות בשימוש נרחב, לתת מידע מוגבל על יעילות הרבייה. הסימן הכי טוב של איכות הזרע הוא הערכת פוטנציאל המפרה.

לאחרונה, הקבוצה שלנו להשתמש בשיטה כדי להעריך דולפין הזרע להפרות את הפוטנציאל על-ידי הערכת היווצרות pronuclear זכר ו/או היברידית היווצרות העובר לאחר IVF heterologous באמצעות zona oocytes שור שלם3. השימוש של דולפין-שור heterologous IVF יש יתרונות חשובים מעל הומולוגי להפריה חוץ גופית, כמו זה מתגבר על הקושי בהשגת דולפין oocytes ואסטמה ומקילה על השימוש נבדק היטב במבחנה oocyte שור ההבשלה במערכות. כדי למנוע ירידה לפרטים מינים, heterologous ההפריה מבוצעת בדרך כלל בהעדר מסוג ZP. למרות שהיא מתירה על ההערכה ליכולת של spermatozoa acrosome הגיב להתמזג עם קרום vitelline, זה מחליש את ההערכה של תכונות אחרות הקשורות הפריה. ההליך המתואר משתמשת zona oocytes ללא פגע, מאפשר הערכת הפרמטרים הבאים: איגוד zona הזרע מצורף, חדירה, polyspermy, היווצרות pronuclear ואני היברידית העובר המחשוף.

כאן, אנו מציגים מספר פרוטוקולים עבור איסוף זרע, זרע בסיסית ניתוח, spermatozoa קפוא, כמו גם הערכת הפונקציונליות זרע דולפין על-ידי הערכת זכר pronuclear ו/או היברידית העובר היווצרות לאחר heterologous IVF באמצעות zona ללא פגע oocytes שור.

Protocol

אתיקה משפט: כל ההליכים ניסיוני היו נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של y אינסטיטוטו נאסיונאל דה Investigación Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). כל הניסויים בוצעו בהתאם לקו המנחה על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, כפי שאומצה על ידי אגודת המחקר של רבייה, וכדי חוק רווחת בעלי חיים לטי…

Representative Results

כל תוצאות, טבלאות או איורים (1 ו 2) המובאת כאן שוחזר עם הרשאה3. דולפין spermatozoa יש תנועתיות גבוה לאחר הקפאה והפשרה שופך הדולפין קפוא-הקרת הראה באחוזים (% ± SD) של 84.5 ± 5.3 הכוללת תאי ואין 69.1 ± 5.1 spermatozoa תאי …

Discussion

עבור מינים רבים יונקים שונים, ישנם יתרונות מגוונים לשימוש זרע קפוא-הקרת. אלה כוללים את היכולת להעביר חומר גנטי בעל ערך, את הפוטנציאל להפצה ברחבי העולם, הסיכון נמוך של זיהום, את היכולת לשמר את זכר גמטות במשך עשרות שנים. השימוש cryopreserved הזרע חיוני דולפינן, כי מין זה מוגן תחת נספח ב- CITES, אשר מגביל…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודתו מומן על ידי משרד ספרדית של הכלכלה ואת התחרותיות (AGL2015-70140-R ל ד Rizos), AGL2015-66145R א גוטיירז-אדן, ג’יי פ פרז-גוטיירז. סנקה קרן מורסיה (גרנט 20040/נבט/16 ל פ גארסיה-ואסקז)

Materials

FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

References

  1. Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
  2. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
  3. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
  4. Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
  5. Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
  6. Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
  7. Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
  8. Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
  9. Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
  10. Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
  11. Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
  12. Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
  13. Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).

Play Video

Cite This Article
Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

View Video