دلافين الدلفين (Tursiops truncatus) المني: جمع، ونعد، والإخصاب في الأنابيب مغايرة
Summary
نقدم هنا، البروتوكولات التي استخدمت بنجاح لجمع المني الدلفين ونعد مغايرة أداء التلقيح الاصطناعي باستخدام بويضات الأبقار.
Abstract
استخدام المني دولفين cryopreserved يسهل تبادل المواد الجينية بين الحدائق المائية ويجعل المني الوصول إلى مختبرات للدراسات زيادة فهمنا لاستنساخ الثدييات البحرية. مغايرة التلقيح الاصطناعي، بديلاً للتلقيح الاصطناعي مثلى، يمكن أن توفر وسيلة لاختبار خصوبة الحيوانات المنوية المحتملة؛ لدراسة علم وظائف الأعضاء مشيج والتنمية الجنين في وقت مبكر؛ وتجنب استخدام بويضات دولفين القيمة، التي يصعب الحصول عليها. نقدم هنا، البروتوكولات التي استخدمت بنجاح لجمع وكريوبريسيرفي المني الدلفين. يتم جمع السائل المنوي بالتحفيز اليدوي على الدلافين المدربة. يتم إنجاز تجميد استخدام تريس صفار بيض على أساس موسع مع الجلسرين. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم من بروتوكول التي تصف مغايرة التلقيح الاصطناعي باستخدام المني الدلفين وبويضات الأبقار وأن يتحقق من طبيعة هجينة من الأجنة الناتجة باستخدام PCR. يثير تساؤلات حول التسميد التسميد مغايرة ويمكن استخدامها كأداة لدراسة فسيولوجيا مشيج والتنمية الجنين في وقت مبكر. وبالإضافة إلى ذلك، يوضح نجاح التلقيح الاصطناعي مغايرة إمكانات هذا الأسلوب لاختبار دولفين الحيوانات المنوية إخصاب القدرة، التي تستحق مزيدا من الدراسة.
Introduction
تقنيات مساعدة الإنجاب هي متطورة في الحيوانات البرية، بما في ذلك الثدييات البحرية. عدم وجود أساليب حساسة لتقييم نجاح صنع الأسمدة الحيوانات المنوية يساهم في بطء تطور تقنيات الإنجاب في الأنواع مثل الدلفين. لم يكن حتى وقت قريب أن البارامترات الأساسية المنوي من قاروري (Tursiops truncatus) تم الإبلاغ عن1،2. ومع ذلك، متغيرات مثل حركية ومورفولوجيا، على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع، تعطي معلومات محدودة عن الكفاءة التناسلية. أفضل مؤشر لنوعية الحيوانات المنوية هو تقييم إمكانية صنع الأسمدة.
في الآونة الأخيرة، استخدمت مجموعتنا طريقة لتقييم دولفين الحيوانات المنوية إخصاب المحتملة بتقييم تكوين pronuclear الذكور و/أو تشكيل الجنين المختلطة بعد التلقيح الاصطناعي مغايرة استخدام زونا بويضات الأبقار سليمة3. مزايا هامة أكثر من التلقيح الاصطناعي مثلى، كما أنها تتغلب على صعوبة الحصول على بويضات دولفين استخدام البقر دولفين مغايرة التلقيح الاصطناعي ويسهل استخدام المجربة في المختبر البويضيه البقري نضوج نظم. تفاديا لخصوصية الأنواع، يتم التسميد مغايرة عموما في غياب ZP. على الرغم من أنه يسمح لتقييم قدرة المني acrosome-ورد أن تلتحم مع الغشاء فيتيلين، أنه يعوق تقييم الميزات الأخرى المتصلة بالتخصيب. الإجراء المذكور يستخدم زونا بويضات سليمة ويسمح بتقييم المعلمات التالية: الحيوانات المنوية زونا والملزمة ومرفق، الاختراق، بوليسبيرمي، وتشكيل برونوكليار، الانقسام هجين والجنين.
هنا، نحن نقدم عدة بروتوكولات لجمع الحيوانات المنوية وتحليل الحيوانات المنوية الأساسية، وتجميد المني، فضلا عن تقييم وظائف الحيوانات المنوية دولفين بتقييم الذكور برونوكلير و/أو الهجين تكوين الجنين بعد التلقيح الاصطناعي مغايرة استخدام زونا سليمة بويضات الأبقار.
Protocol
Representative Results
Discussion
للعديد من أنواع الثدييات المختلفة، هناك مزايا متنوعة لاستخدام الحيوانات المنوية المجمدة-مذاب. وتشمل هذه القدرة على نقل المواد الجينية قيمة وإمكانات لتوزيعها في جميع أنحاء العالم وانخفاض خطر التلوث والقدرة على الحفاظ على الأمشاج الذكور على مدى عقود. استخدام الحيوانات المنوية cryopreserved ضرو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد مولت عمله الإسبانية وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية (AGL2015-70140-R إلى ريزوس د)، AGL2015-66145R أن جوتيريز-عدن أ وج. ف. بيريز-غوتييريز ومؤسسة مورسيا سينيكا (20040 المنح/الجرثومية/16 إلى ف. غارسيا-فاسكيز)
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
