Grand Dauphin (Tursiops truncatus) spermatozoïdes : Collection, cryoconservation et la fécondation In Vitro hétérologue
Summary
Nous présentons ici les protocoles qui ont été utilisées avec succès pour la collection de spermatozoïdes de Dauphin, cryoconservation et les performances FIV hétérologue ovocytes bovines.
Abstract
L’utilisation de spermatozoïdes cryoconservés Dauphin facilite l’échange de matériel génétique entre les parcs aquatiques et rend les spermatozoïdes accessible aux laboratoires d’études afin d’améliorer nos connaissances de la reproduction des mammifères marins. FIV hétérologue, un remplacement pour une FIV homologue, pourrait fournir un moyen de tester la fertilité du sperme potentielle ; pour étudier la physiologie des gamètes et début du développement embryonnaire ; et d’éviter l’utilisation d’ovocytes Dauphin précieux, qui sont difficiles à obtenir. Nous présentons ici les protocoles qui ont été utilisées avec succès pour recueillir et cryopréserver des spermatozoïdes de Dauphin. La collecte de sperme s’effectue par stimulation manuelle des dauphins formés. Cryoconservation s’effectue à l’aide d’un extenseur de jaune d’oeuf-basée de TRIS avec le glycérol. En outre, nous présentons un protocole décrivant les FIV hétérologue utilisant Dauphin spermatozoïdes et les ovocytes bovines et qui vérifie la nature hybride de l’embryon qui en résulte, à l’aide de la PCR. La fécondation hétérologue soulève des questions sur la fécondation et peut servir comme un outil pour étudier la physiologie des gamètes et début du développement embryonnaire. En outre, le succès de la FIV hétérologue démontre le potentiel de cette technique pour tester le sperme Dauphin fertilisation de capacité, qui mérite un examen plus poussé.
Introduction
Techniques de procréation assistée sont peu développés chez les animaux sauvages, y compris les mammifères marins. L’absence de méthodes sensibles pour évaluer la réussite fécondante du sperme contribue au développement lent des technologies de la reproduction chez les espèces comme les dauphins. Il n’était pas jusqu’à une date récente que les paramètres fondamentaux séminales du grand dauphin (Tursiops truncatus) ont été signalés1,2. Toutefois, des variables telles que la motilité et la morphologie, bien que largement utilisé, donnent des informations limitées sur l’efficacité reproductive. Le meilleur indicateur de la qualité du sperme est l’évaluation du potentiel fécondatrice des cultures.
Récemment, notre groupe a utilisé une méthode pour évaluer les spermatozoïdes Dauphin potentiel de la fertilisation en évaluant la formation pronucléaire mâle et/ou formation d’embryon hybride après FIV hétérologue utilisant zona intact ovocytes bovine3. L’utilisation de la FIV hétérologue Dauphin-bovin a des avantages importants par rapport aux homologues FIV, car il permet de surmonter la difficulté d’obtenir des ovocytes de Dauphin et facilite l’utilisation de bien testé in vitro bovine oocyte maturation des systèmes. Afin d’éviter la spécificité d’espèce, la fécondation hétérologue est généralement réalisée en l’absence de ZP. Même si elle permet l’évaluation de la capacité des spermatozoïdes acrosome-réagi à fusionner avec la membrane vitelline, elle porte atteinte à l’évaluation d’autres fonctionnalités liées à la fertilisation. La procédure décrite utilise zona ovocytes intacts et permet l’évaluation des paramètres suivants : liaison de zona de sperme et attachement, pénétration, polyspermie, formation pronucléaire et clivage embryon hybride.
Nous présentons ici plusieurs protocoles de prélèvement du sperme, base spermogramme, congélation de spermatozoïdes ainsi que l’évaluation de la fonctionnalité de sperme Dauphin en évaluant mâle pronucléaire et/ou hybrides formation des embryons après FIV hétérologue utilisant zona intact ovocytes bovines.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour de nombreuses espèces de mammifères différents, il y a divers avantages à l’utilisation de sperme congelé-décongelé. Celles-ci comprennent la possibilité de transférer le matériel génétique précieux, le potentiel de distribution dans le monde entier, le faible risque de contamination et la capacité de préserver des gamètes mâles pendant des décennies. L’utilisation de spermatozoïdes cryoconservés est essentielle pour le grand dauphin, parce que cette espèce est protégée en vertu de l’ann…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ses travaux ont été financés par le ministère espagnol de l’économie et la compétitivité (AGL2015-70140-R à D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan et J. F. Pérez-Gutiérrez et Seneca Fondation de Murcie (Grant 20040/germe/16 à F. García-Vázquez)
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
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