Un protocole optimisé pour la maturation in vitro des ovocytes de poisson zèbre utilisés pour la manipulation de produits de gènes maternels est présenté ici.
événements cellulaires qui ont lieu pendant les premiers stades du développement embryonnaire des animaux sont entraînés par des produits de gènes dérivés maternellement déposés dans l'ovocyte en développement. Parce que ces événements se fondent sur des produits maternels qui agissent généralement très rapidement après la fécondation qui préexistent à l'intérieur de l'œuf, les approches standard pour l'expression et la réduction fonctionnelle impliquant l'injection de réactifs dans l'œuf fécondé sont généralement inefficaces. Au lieu de cela, ces manipulations doivent être effectuées au cours de l'ovogenèse, avant ou pendant l'accumulation de produits maternels. Cet article décrit en détail un protocole pour la maturation in vitro d'ovocytes immatures et leur poisson zèbre fécondation in vitro ultérieure, ce qui donne des embryons viables qui survivent à l' âge adulte. Cette méthode permet la manipulation fonctionnelle des produits maternels au cours de l'ovogenèse, comme l'expression de produits pour le sauvetage phénotypiques et la visualisation de construction marquée, ainsi que d'uns la réduction de la fonction des gènes par des agents génétique inverse.
Au cours du développement des animaux, les dépôts mère produits de gènes (par exemple, ARN, protéines et autres biomolécules) dans l'œuf; ces produits sont importants pour les processus cellulaires précoces immédiatement après la fécondation 1, 2. La manipulation de l'expression et la fonction des produits maternels est généralement inefficace lors de l' utilisation d' une approche standard pour l'injection de réactifs dans les œufs fécondés 3. En effet, la plupart des ARN et les protéines sont produites par l'ovocyte pendant oogenesis, afin que les produits maternels pré-chargés sont déjà présentes dans l'œuf mature. De tels produits préexistants sont imperméables à l'effet de choc fonctionnel avec des agents de ciblage de gènes, tels que les oligonucleotides antisens morpholino (MOS), car OM cible l'ARNm, la protéine non préexistante déjà présent dans l'oeuf lors de la fécondation. En outre, de nombreux premiers processus embryonnaires arrivent trop tôt après la fécondation à influenced par des produits protéiques dérivés de l'ARN injecté dans l'ovule fécondé, comme l'ARN ne peut pas être produit assez rapide pour influencer les premiers événements de l'embryogenèse. Pour la même raison, des protéines de fusion marquées exprimées par une injection d'ARNm dans l'ovule fécondé ne peut être produit à temps pour la visualisation au cours de leur rôle actif dans l'embryon précoce. L' injection dans des ovocytes matures extrudées avant l'activation des œufs est possible , mais est associée à des problèmes techniques similaires: ces oeufs matures sont déjà pré-chargés avec des protéines de la mère, et ils ne deviendront pas traductionnelle actifs (c. -à- produire des protéines à partir de transcrits exogènes) qu'après l' œuf Activation. Pour ces raisons, la manipulation des produits de gènes maternels qui agissent au début de l'embryogenèse doit généralement être réalisée au cours oogenesis dans la maturation ovocytaire.
Comme on approche de surmonter ces obstacles, dans les méthodes de maturation in vitro, qui permettent la maturation des OOCYTES de l'étape IV à la formation d'oeuf, ont été mis en place chez le poisson zèbre. Les premières méthodes ont permis la maturation in vitro, mais les ovules matures résultant ne sont pas compétents pour la fertilisation 4. Par la suite, la manipulation des conditions de culture de neutre à pH 9,0, imitant le pH alcalin du liquide ovarien trouvée dans les espèces de poissons 5, 6, a permis pour la fécondation in vitro fiable (FIV) , après maturation in vitro 7, 8. En effet, in vitro des ovocytes -matured peuvent produire des embryons viables qui survivent à l' âge adulte et qui sont fertiles 3, 8. Cette amélioration de la méthode a été adapté pour inclure la manipulation fonctionnelle des gènes maternels, l'expression des protéines marquées pendant l'ovogenèse zebrafish par l'expression exogène, et à médiation MO-cognement fonctionnelle dans matétape de urant IV oocytes 3 (figure 1).
Zebrafish ovogenèse présente un certain nombre d'étapes caractéristiques menant à la formation d'ovocytes matures 9 (voir le tableau 1 pour un guide rapide pour les différentes étapes de l' ovogenèse). En bref, le développement de l'ovocyte est initié par la phase I est arrêté et ovocytes au stade de diplotene de prophase I de la méiose. Ces ovocytes sont soumis à la croissance par transcription active (initié au cours des étapes IA et IB), la formation d'alvéoles corticales (également connu sous forme de granules corticales, initié lors de l'étape II), et vitellogénèse (initié lors de l'étape III). la croissance ovocytaire est achevée au cours de la phase IV, lorsque la méiose I reprend, entraînant le démontage du noyau de l'ovocyte, appelée la vésicule germinale (GV). , Méiose est ensuite à nouveau arrêté à la métaphase II. L'achèvement de la croissance de l'ovocyte et arrêt de la méiose durant la phase IV conduit à une phase de maturité V par exempleg 9. L'élimination de la membrane folliculaire se produit lors de la libération de l'ovocyte dans la lumière de l'ovaire 10 et est essentielle pour la fécondation et de l' activation de l' œuf approprié. Une fois que les œufs sont extrudées de la mère lors de l'accouplement naturel, ils sont activés. Chez le poisson zèbre, l' exposition à l' eau est suffisante pour l' activation de l' œuf plein, quelle que soit la présence de spermatozoïdes 11.
Dans des conditions in vitro permettent actuellement pour la maturation des oocytes de stade précoce IV, qui peuvent être reconnus par leur taille (690-730 pm), la présence d'un grand GV dans une position asymétrique, et une apparence totalement opaque en raison de l'accumulation de les protéines de jaune d'oeuf (figure 2B) -à l'œuf stade de maturité de V, caractérisé par un GV entièrement démonté et une apparence translucide due au jaune maturation de la protéine 12 (figure 2C). Dans cette approche, les ovaires entiers suiteovocytes Aining à différents stades de développement sont prélevés sur des femelles. Les ovocytes sont autorisés à se développer dans 17α-20β-dihydroxy-4 prégnène-3-one (DHP), une hormone de maturation efficace induisant 8. Au cours de cette période, les ovocytes de maturation peuvent être manipulées par l'injection d'expression (par exemple, coiffé in vitro -transcribed ARNm) ou des agents génétique inverse (par exemple, OM). La couche folliculaire ne jette pas spontanément vers la fin de la période de maturation, il doit donc être supprimé manuellement. Après defolliculation, la fécondation in vitro est obtenue en déclenchant l' activation de l' œuf par l'exposition des oeufs à l' eau (présent dans le milieu embryonnaire (E3)) 13 et une solution de sperme. Les zygotes résultant subissent le développement embryonnaire et permettent l'évaluation de la capacité des traitements à manipuler la fonction des gènes de la mère et pour la visualisation et l'analyse des produits maternels marqués ( <strong> La figure 3).
Le protocole ci-dessus est pour la manipulation de produits de gènes avant la fécondation, permettant ainsi l'étude des produits de gènes maternels au début embryon de poisson zèbre. Des études antérieures ont pu ovocytes matures in vitro 4; ce protocole a été modifié afin de permettre la fertilisation ultérieure d' une maturation in vitro des ovocytes 8. Cela permet l'injection de réactifs pour la manipulation fonctionnelle et la visualisation des produits hérités du maternellement embryon précoce 3. Embryons résultant de cette méthode peut être viable et peuvent survivre à devenir des adultes fertiles. Dans des expériences préliminaires, environ la moitié des embryons fécondés issus de cette procédure étaient viables au jour 5 du développement, évaluée par l'inflation de la vessie natatoire à ce stade, dont environ la moitié est devenu adultes en bonne santé, fertiles (observations non publiées).
Il y a un certain nombredes étapes critiques à prendre en compte dans le protocole. Oocytes au stade d'initier la maturation appropriée (stade précoce IV) peut être enrichi si la femelle a été accouplées récemment, mais pas avant 8 dpp. L' utilisation du poisson qui ont peut – être pas accouplées récemment entraîner des œufs dégénérant 14, qui ne sera pas subir une maturation. Les femelles fécondées en moins de 8 jours auront la majorité des œufs au stade III ou moins, et donc, les œufs ne mûriront pas correctement in vitro. Ovaires chez les femmes qui accouplées 8 jours seront avant ont une fraction optimale des ovocytes au début de stade IV. Ceux – ci peuvent être reconnus par leur opacité et la présence du GV dans une position excentrée (figure 2B). Ovocyte détermination du stade peut également être facilité par la mesure de la taille, avec des oocytes placées sur une lame de micromètre gradué sous un microscope et par rapport aux lignes directrices d'arrêt standard (tableau 1). Cependant, à un stade précoce des ovocytes IV ont une taille quasi maximale par rapport à la maturité(ovocytes reconnus par leur transparence relative et l' absence de GV, la figure 2C) et sont faciles à reconnaître, comme décrit ci – dessus, qui évite généralement la nécessité d'une mesure de la taille de l' ovocyte directe.
La maturation in vitro doit débuter dans quelques heures de la fin du cycle de la lumière du jour auquel les donneurs d'ovocytes féminins sont acclimatés. Oocytes ne mûriront pas correctement, reflétée dans les taux de fécondation pauvres, si cultivés pendant la période du matin du cycle de lumière. La raison de la dépendance circadien de la méthode de la maturation ovocytaire in vitro n'est pas comprise , mais reflète probablement les préjugés sous – jacents circadiens in vivo la maturation des œufs impliquant un cycle d' expression des gènes au cours oogenesis 21. Une cause commune pour défaut d' ovocytes à subir avec succès dans la maturation in vitro malgré la mise en scène appropriée ovocytaire est que le DHP est arrivé à expiration. hormone DHP expire généralement après un an, et pour assurer l'effetmaturation ive, le lot de travail doit être remplacée dans un délai de 9 mois d'utilisation.
L'injection d'oocytes est une autre étape essentielle lorsque le but de la méthode est la manipulation fonctionnelle des produits maternels. Cette procédure a des exigences qui diffèrent de celles des injections standard dans l'œuf fécondé à 0-30 FPM. Un facteur clé dans l' injection de ovocyte est la nécessité d'effectuer les injections dans des conditions qui ne conduisent pas à l' activation des œufs prématurés, comme dans Leibovitz le milieu L-15 22, 23. Parce qu'ils sont intégrés dans les ovaires, la maturation des ovocytes posent des problèmes particuliers à injection. Le protocole ci-dessus suggère dissociant premier ovocytes à partir des ovaires, puis en maintenant chaque ovocyte dissocié séparément avec une pince pendant l'injection. Cette technique a bien fonctionné et permet ovocytes de pré-tri au stade approprié avec un minimum de manipulation. Des méthodes alternatives peuvent également être utilisées,en tant que: i) placer oocytes dans injection standard auges agarose 15, dans lequel les parois verticales du support de goulotte du ovocytaire lors de l' injection (dans cette variante de procédé, les ovocytes ont besoin d'être transférées à des plaques d'injection tout en étant maintenue in vitro milieu de maturation) et ii ) permettant aux ovocytes de rester attachés à la masse de l'ovaire, qui peut être maintenu avec une pince pendant l'injection pour éviter tout contact avec l'ovocyte injecté (dans cette approche, les ovocytes doivent être dissociées après l'injection à la fois faciliter l'exposition DHP et de permettre leur defolliculation , elle-même indispensable pour la fécondation in vitro). Malgré ce défi particulier, le stade IV ovocytes peuvent être pénétrées facilement avec une aiguille d'injection, probablement parce que la membrane chorionique à ce stade n'est pas complètement développé 9.
Une limitation du protocole de maturation actuelle est que dans des conditions de maturation in vitro qui favorisent le développement de l' ovocyte appropriéne peut pas être créé lors de la maturation ovocytaire est initiée aux premiers stades de stade IV. Les ovocytes deviennent compétents pour répondre aux DHP en subissant une maturation quand ils atteignent un diamètre de 520 um, ce qui se produit lors de l' étape III (vitellogénèse, correspondant à la gamme 340 à 690 pm) 9. Cependant, la culture des ovocytes de stade III des résultats dans les ovocytes qui ne sont pas compétentes pour la fertilisation 3. Ovocytes dont la culture ne in vitro est initiée au stade IV (figure 2B) peut se développer dans des ovocytes, stade V matures (figure 2C et D). Cela peut être lié au fait que le stade III est essentiel pour la croissance et vitellogénèse ovocyte 9. Ainsi, la procédure de maturation ovocytaire in vitro présentées dans cet article ne doit être utilisé avec une population à partir d'ovocytes stade IV (B), et non avec des ovocytes à des stades précoces (stades I – III; Figur e <strong> 2A). Pour la même raison, cette procédure est limitée à des gènes qui sont exprimés au stade IV ou plus tard. La manipulation fonctionnelle des gènes dont les produits sont exprimés plus tôt peut plutôt compter sur des méthodes génétiques (voir ci-dessous). Des améliorations à des méthodes in vitro de maturation de la culture pourraient à l'avenir permettre l'initiation de la culture de l' ovocyte à des stades précoces, élargissant ainsi la puissance de l'approche de la maturation in vitro.
Une autre limitation de la méthode présentée est que defolliculation, ce qui est essentiel pour les étapes ultérieures impliquant la fécondation, est actuellement une étape limitante dans la procédure. La membrane folliculaire est une couche transparente qui entoure l'ovocyte en développement, et le retrait peut être fastidieux. Si cette membrane est pas complètement enlevée, l'œuf ne deviendra pas complètement activé et fécondé. Ceci est rendu évident par l'échec du chorion d'étendre et le développement de façon irrégulière placé, sillon comme structures (pseudocleavages), caractéristique d'embryons non fécondés 11. Méthodes de defolliculation Enzymatic telles que la collagénase, tel qu'il est utilisé dans Xenopus, ont été essayés. Cependant, dans nos mains, cette technique n'a pas été couronnée de succès, et nous comptons donc sur defolliculation manuel. Parce que defolliculation manuel de main-d'œuvre et de temps, il est difficile d'obtenir de grands lots d'œufs fécondés in vitro après la maturation ovocytaire. En raison de la limitation dans le temps imposé par defolliculation manuel, nous fertiliser actuellement quelques œufs défolliculés, matures à la fois, en petits lots de 5-10 œufs. L'incorporation de defolliculation enzymatique avec cette procédure augmenterait probablement considérablement son rendement et la facilité d'utilisation.
Bien que les embryons produits après la fécondation des ovocytes -matured in vitro peuvent devenir des adultes viables, nous notons que , après fécondation in vitro, une fraction d'embryons faire pas diviser normalement ou en temps opportun. Nous sélectionnons actuellement pour les lignes dont la propagation comprend cycles de maturation in vitro des ovocytes, ce qui peut entraîner des modèles plus robustes de développement dans les embryons obtenus par cette méthode.
La procédure a permis le sauvetage ou la visualisation claire de la localisation des protéines pour un certain nombre de mutations 24, 25. Cependant, pour certains gènes, la régulation de l' expression du produit peut être cruciale, de sorte que les produits exprimés par l' ARNm injecté peuvent conduire à des résultats variables 26. Il est également important de garder à l' esprit de tous les contrôles (par exemple, des embryons injectés avec des réactifs qui ont des propriétés similaires à celles utilisées dans l'expérience encore sont prévus pour ne pas produire un effet, comme mos contrôle ou ARN codant pour des protéines inertes que, par exemple comme GFP), la variabilité sous-jacente peut conduire à des conclusions incorrectes.
nt "> Une approche impliquant la manipulation in vitro suivie par la fécondation est particulièrement utile dans le cas des produits déposés maternellement, où la méthode standard d'injection d' ARN, mos ou de protéines dans l'ovule fécondé ne peut pas réduire efficacement les produits déjà accumulés dans l'œuf. d' autres méthodes récemment mises au point, comme la production d'CRISPR-mutant, sont également efficaces pour générer des conditions mutantes pour les gènes maternellement exprimés 26. Cependant, cette méthode nécessite la croissance de plusieurs générations de poissons. la technique de maturation ovocytaire in vitro permet la manipulation fonctionnelle rapide à étudier la fonction des gènes exprimés maternellement, y compris le sauvetage et phénocopies de mutations à effet maternel, ainsi que l'expression de l'ARN et des protéines dans l'embryon précoce.The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier les membres de l'installation laboratoire et poissons Pelegri personnel d'encadrement, qui ont joué un rôle dans la facilitation de ce projet. Le support de ce projet a été fourni par le NIH et le NIH R56 GM065303 2 T32 GM007133 à ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 et NIH 2 T32 GM007133 à CCE, et NIH RO1 GM065303 à FP
Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
CaCl2 | Sigma | C7902 | |
MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
Plastic spoon | available in most standard stores | ||
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
Ice bucket | any maker | ||
Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
Paper towels | any maker | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
Timer stop watch | any maker | ||
Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
BSA | Sigma | A2058 | |
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
gentamicin | Sigma | G1272 | |
Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
Micropipetor (1-20 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (20 – 200 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (100 – 1000 µl range) with tips | any maker | ||
Conical tubes 15ml | any maker | ||
Conical tubes 50ml | any maker | ||
plastic pipette 10 ml with bulb | any maker | ||
plastic pipette 20 ml with bulb | any maker | ||
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
Reagents for fish water: | |||
Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
Reagents for E3 medium: | |||
NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
KCl | Sigma | P5405-500G | |
CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
Fish Food: | |||
Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |