מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em> במבחנה</em> הבשלת ביצית דג הזברה

כל דג הזברה טופלה בהתאם קפדנים עם תרגול חיה טוב, כפי שהוגדרה על ידי הגופים רווחי בעלי החיים לאומיים ו / או מקומי הרלוונטיים, וכל העבודה בבעלי החיים אושרה על ידי הוועדה המתאימה (אונ' A3368-01 מספר האבטחה ויסקונסין-מדיסון). בעלי החיים יוחזקו בתנאים סטנדרטיים ב 26.5 מעלות צלזיוס. 1. טרום בחירה של נקבות הערה: ביציות יכולות נשים בוגרות משתרעות בדרך כלל מגוון של שלבים התפתחותיים, משלב I עד V (איור 2). טיהור הנקבות של ביציות קודמות באמצעות הזדווגות טבעית מוצלחת מגדילה את הסנכרון של היערכות ביצית, כפי שזה עתה בפיתוח ביציות להופיע בתור עוקבה 3, 14. בתוך כ 8 ימים לאחר טיהור, רוב הביציות נמצאות IV בשלב מוקדם, שבו הוא אופטימלי עבור החניכה של הבשלה במבחנה. סנכרון כזה מגדיל את התשואה של ביציות that יכול לעבור את התהליך המלא של הבשלה במבחנה, הקלת מניפולציה ניסויית. ראה 13 תיאורים קודמים לפרטים על הקמת דגי הזדווגויות זיווג ועל הרכב מים ודגים (כאן, 14 גרם של מלח ים 150 גרם של NaHCO 3 ל -1,000 ליטר של מים אוסמוזה הפוכים, pH 6.5-8.5 (טווח מועדף: 6.8 -7.5) לבין מוליכות של 180-360 מיקרו-שניות). ראה ואח 'ברנד. 13 מתכונים נוספים. שמונה עד עשרה ימים לפני המניפולציה תרבות חוץ גופית, השתמשו ברשת דגים להעביר זכר יחיד דג נקבה אחת של זן הרצוי טנק ההזדווגות. קבוצות מרובות זוג. השאירו אותם בן לילה טנק ההזדווגות. אפשר להם להזדווג במהלך הערב ושעות אחר הצהריים של יום המחרת. השתמש נטו דגים להפריד את הנקבות כי להניב ביצים במהלך ההזדווגות ולמקם אותם למיכל נפרד. Feed הנקבות האלה פעמיים ביום עם תערובת מזון containing כ כמות שווה של ארטמיה פתיתי מזון לדגים. כמות המזון צריכה להיות מספיק כדי לספק כ 20 דקות, אבל לא יותר, זמן האכלה. 2. הכנת התבגרות בינונית הערה: כן בינוני התבגרות ביום הניסוי הבשל חוץ גופייה, בתוך 1 h של הסרת הביציות מן הנקבה (ראה סעיף 3). להוסיף 20 מ"ל של מדיום L-15 של ליבוביץ עם-גלוטמין L, pH 7.0, צינור חרוטי 50 מ"ל בתנאים סטריליים. תביאו אותו pH 9.0 עם 10 N NaOH. להוסיף 9 מיליליטר של מדיום L-15 של ליבוביץ, pH 9.0, כדי 2 צינורות חרוטים נפרדים 50 מיליליטר. לייבל 1 צינור "+ DHP" והשני "-DHP." בשנת הצינור + DHP, להוסיף 10 μL של 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-אחד (DHP), 490 μL של DH 2 O, ו 500 μL של אלבומין 10% שור (BSA). בשנת הצינור -DHP, להוסיף 100 μL של 10 מ"ג / מ"ל ​​gentamycin, 40081; L של DH 2 O, ו 500 μL של 10% BSA. 3. Dissection של ביציות וייזום של תרבות חוץ-גופית הערה: ניסוי התרבות במבחנה מתבצע עם נקבות שנבחרו מראש 8-10 ימים אחרי שהם משחררים ביצים באמצעות הזדווגות טבעית. השתמש בינוני בשל שנעשה באותו היום (ראה סעיף 2). ביציות בוגרות כראוי אם לנתיחה החלה סמוכות לסוף מחזור ימי הדגים (נקבע במעבדה על ידי תאורה מלאכותית שנקבע מראש במתקן הדגים) 13, ואולי מחקה תהליכים המתרחשים באמצעות הזדווגות טבעית. משמעות הדבר היא כי רוב השלבים פרוטוקול חייב להתבצע בשעות הערב אם הדגים הם שוכנו במתקן עם מחזור אור רגיל (למשל, מתחילה בצעד 3.2 בשעה 6 בערב במתקן עם תקופת האור 8 am כדי 10 בלילה), למרות עבודה בזמן תקופות אחרות אפשריות עם מחזור אור זמן שהוסט כראוי. כן פתרון מניות 0.2% tricaine ב DH 2 O, שנאגר עד 7.0 pH עם 1 M טריס, pH 9.0, ולשמור את הפתרון הזה ב 4 ° C. זה יכול להיות מוכן מראש. ליזום את h הניסוי 0-4 לפני סוף מחזור האור היומי במתקן. בכוס 250 מ"ל, להוסיף 20 מ"ל של פתרון מניות 0.2% tricaine, pH 7.0, 80 מ"ל של מים ודגים ומערבבים. מעבירים את הנקבות שנבחר מראש פתרון tricaine ו להרדים אותם על ידי חשיפת יתר. השאר את הנקבות בפתרון tricaine עבור 15 דקות לאחר הפסקת תנועת זימים. בעזרת כף, לאסוף את הדגים מורדמים מפתרון tricaine ולשטוף אותם בקצרה במים דגים. מניחים את הדג על גבי מגבת נייר כדי לספוג את עודפי המים. השתמש סכין גילוח נקי לערוף את הדגים מורדמים ברמה של סנפיר החזה. בעזרת מספריים לנתח, לעשות חתך אורכים בצד הגחון של הדג, הרחבת המסוף הקדמי לאזור האנאלי. <li> מניח את הדג על צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ לנתח עם אור האירוע. בעזרת זוג מלקחיים לנתח, להעביר חלקים השחלה אל צלחת תרבות 35 x 10 מ"מ המכיל 4 מ"ל של מדיום L-15 של ליבוביץ + DHP. הערה: השחלות, אשר מכילות ביציות מתפתחות, תופענה מבנים אטומים וגבשושיים בתוך חלל הגוף הפנימי. בעזרת מלקחיים לנתח, לנתק את הביציות בעדינות מן המוני זקיקים. מיין ביציות מוקדם בשלב IV (איור 2B; לפני התמוטטות GV, בגודל כמעט מירבית מאופיין הציטופלסמה כהה, אטום ו GV ברורה ממבט הממוקם סימטרית בתוך הביצית). בטל ביציות בשלבים מוקדמים יותר (איור 2 א) וביצי V הבמה שקופות, בוגרת (דומות לאלה באיור 2C אך נוכח השחלות לפני טיפול DHP). הערה: ביציות נבחרות התבגרות ב IV בשלב מוקדם, בשלב המוקדם שתוצאתו oocyt הבוגרת, השלב החמישיes אחרי התנאים תרבות במבחנה (איור 2C ו- D) 3. בגלל ביציות בשלב IV מייצרים מוצרים באופן פעיל, מניפולציה בשלב זה מאפשרת ביטוי של מוצרי אקסוגניים באמצעות הזרקת RNA או להפחתת תפקוד הגן באמצעות MOS הציג. השתמש pipet כוס פסטר להעביר ביציות IV בשלב מוקדם כדי בצלחת תרבות הפלסטיק השני 35 x 10 מ"מ המכיל 4 מ"ל של מדיום L-15 של ליבוביץ + DHP. העבר כמויות מינימליות של המדיום -DHP אל צלחת ובה הפתרון + DHP. 4. microinjections ביצית הערה: מבודד בשלב IV ביציות עוברת בתהליך הבשלה במבחנה ניתן microinjected להציג ריאגנטים עבור מניפולציה תפקודית או ביטוי חלבון מתויג. את microinjection של ריאגנטים, כגון mRNA ו MOS (ראה סעיף 4), הוא בדרך כלל מתבצע כאשר הביציות עוברות במבחנת matuיחס במדיום + DHP, לפני defolliculation. אם תרצה, כדי לאפשר יותר זמן לנהל מניפולציות לפני הבשלת ביצית, הזריקות יכולות להתבצע גם במדיום -DHP, לפני ההבשלה, עבור h 2 לפחות. הם יועברו לאחר מכן עד בינוני + DHP. כן תעתיק באמצעות ערכת ביטוי סטנדרטית. להשאיר אותן -80 ° C כמו מניה 100-500 pg / μL להזרקה בריכוז סופי של 50-500 pg / μL (200 pg / μL מומלץ) במים רנ"א-כיתה. כן MOS בריכוז של 4 ng / μL במים לפי הוראות היצרן. להזריק אותם בריכוזים סופיים של 2 ng / μL (או כפי שנקבע באופן אמפירי). הערה: זריקות בדרך כלל מבוצעים במדיום + DHP לפני defolliculation (ראה הערה בסעיף 5). אם מזריקים mRNA, מיד לפני ההזרקה, לדלל את ה- mRNA באמצעות מים כיתה RNA אוסמוזה הפוכה ו 0.2 M KCl להשיג פתרון סופי של 0.1 M KCl. אם הזרקת MOS, מיד לפני ההזרקה, לדלל את MOS לריכוז הרצוי באמצעות מים אוסמוזה הפוכה ו 0.2 M KCl להשיג פתרון סופי של 0.1 M KCl. ידני להחזיק ביציות עם מלקחיים בסדר להזריק כ 1 NL לתוך ביציות בשלב IV מסוג פרא באמצעות מחט עשתה עם טפטף נימי משך-זכוכית. הכן את המחטים זכוכית על ידי משיכת צינורות זכוכית נימי מחומם, טעינת הפתרון להיות מוזרק, וגם לשבור את קצה המחט עם מלקחיים, כפי שתואר לעיל פרוטוקולים עבור זריקה רגילה לעוברי מוקדם דג הזברה 15. הערה: זה מועיל אם המחט יש להתחדד הדרגתי ולא פתאומי אחד; זה מאפשר יותר גמישות מבחינת המיקום של הפסקה קצה מחט וגם עוזר למנוע נזק לעובר מוזרק. שימוש באותה המחט פתרון באשר הזריקות העוברות, להתאים את עוצמת הקול מוזרק על ידי מראש בקביעההגדרות לחץ microinjector המייצרים את העוצמה הרצויה. ניתן לקבוע הגדרות אלה על ידי מדומה-הזרקת טיפת שמן מינרלי בשקופית כיול הבמה מיקרוסקופ (0.01 מ"מ) והתאמת הגדרות microinjector להשיג בקוטר הרצוי בולוס של פתרון מוזרק, כפי שתואר לעיל 15. 5. הבשלת הביצית ו Defolliculation הערה: במהלך הבשלת ביצית, הביציות תהפוכנה שקופות בהדרגה, אשר מאפשרת ההערכה של תנאי תרבות מוצלחים. המשך הדוגרים בשלה (ובמידת צורך, מוזרקות) ביציות במדיום + DHP ב 26.5 מעלות צלזיוס, מעת לעת הבדיקה (כל 30 דקות) כדי להבטיח כי הביציות להישאר שלמות עוברות התבגרות נאותה על ידי הפיכתו שקופה בהדרגה (ראה איור 2 ג) . הסר ביציות lysing עם פיפטה פסטר וזורקים אותםבכוס פסולת מעבדה כדי לשמור על האיכות של המדיום. חילופי בינוני התרבות עם כ-נפח מחצית בינונית טרי + DHP לשמור פתרון ברור, בהתאם לכמות לתמס ביצית. אפשר בשל במבחנה להמשיך עד ברוב של הביציות להיות שקופים ויש לי GV כי הוא כבר לא נראה לעין (כ 2 h בטיפול DHP, ראו האיור 2C לעומת D). הצג אותם תחת מיקרוסקופ לנתח עם אופטיקה אור מועבר. הסר את קרום הזקיקים החיצוני ביותר מכל ביצית התבגרה. שימוש במלקחיים חוץ-בסדר לעשות קרע בקרום הזקיקים באזור עם שטח מוגבר בין הביצית לבין הממברנה. לקלף חלק הממברנה לגלגל את הביצית מחוץ קרום תוך החזקת חלק מקולף. הערה: קרום כוריוני הבסיסי יהיה בדרך כלל להישאר בשיתוף הדוק עם הביצה במהלך תהליך זה; אחרי ביצת מעשהivation, היא מתרחבת כדי ליצור שכבת מגן על העובר. מעבירים את ביציות defolliculated בנפח מינימלי של המדיום (בדרך כלל, להעביר כ 5-10 ביציות בוגרות תוך פחות מ 20 μL) כדי בצלחת פטרי עם כמה טיפות של תרבות (+ DHP) בינוני ולהמשיך הפריה. 6. הפריה של ביציות בתרבית חוץ-גופית הערה: הפתרון הזרע על הקרח, הכין מתחת, תשמור העוצמה שלה במשך כ 2 h. כן פתרון זרע לקראת סוף שלב הבשלת ביצית ולפני defolliculation אשכים באמצעות מחמש זכרים ב 500 μL של הפתרון הנקס, כפי שתואר לעיל 16, 17. להוסיף 10-50 μL של פתרון הזרע אל ביציות defolliculated במדיום תרבות + DHP. חכו 10 s. בעזרת פיפטה, להוסיף כמה טיפות של עובריים (E3) בינוני ביציות. חכו 1 דקות ולאחר מכן לשטוף את plאכלו עם מדיום E3. הערה: הרכב בינוני E3 היא כדלקמן: 5 מ"מ NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 מ"מ CaCl 2, 0.33 מ"מ MgSO 4, ו 1-5% מתילן בלו 13. חזור על שלבי 5.3, 6.2, ו 6.3 להשיג מספר גדול יותר של עוברים מופרים. אפשר העוברים מופרית לפתח. שימוש במיקרוסקופ לנתח עם אופטיקה האור המועבר לצפות להתקדמות בשלבים מחשוף כדי להבטיח הפריה מוצלחת, כפי שתואר לעיל עבור הפריה 17, וביום 18.