Funktionelle Manipulation der mütterlichen Gene Produkte verwenden<em> In Vitro</em> Oozytenreifung in Zebrabärbling

Alle Zebrabärbling wurden in strikter Übereinstimmung mit dem guten Tier Praxis behandelt, wie von den zuständigen nationalen und / oder lokalen Tierschutzkörpern definiert, und alle Tier Arbeit wurde von dem zuständigen Ausschuß (University of Wisconsin-Madison Sicherung Nummer A3368-01) zugelassen. Die Tiere wurden bei 26,5 ° C unter Standardbedingungen gehalten. 1. Vorauswahl von Frauen HINWEIS: Die Oozyten bei erwachsenen Frauen überspannen typischerweise eine Reihe von Entwicklungsstadien, von Stufe I bis V (Abbildung 2). Bereinigen die Weibchen bereits existierender Eizellen durch eine erfolgreiche natürliche Paarung erhöht die Synchronisation von Oozyten Inszenierung, als sich neu entwickelnden Eizellen als Kohorte erscheinen 3, 14. Innerhalb von etwa 8 Tagen nach dem Abführmittel sind die meisten Eizellen in einem frühen Stadium IV, die für die Einleitung in – vitro – Reifung optimal ist. Eine derartige Synchronisation erhöht die Ausbeute an Oozyten That kann durch den gesamten Prozess von in – vitro – Reifung gehen, experimentelle Manipulation zu erleichtern. Siehe vorherige Beschreibungen 13 für Informationen zum Einrichten von Fisch in gepaart Paarungen und auf Fischwasserzusammensetzung (hier 14 g Meersalz und 150 g NaHCO 3 pro 1.000 Liter Umkehrosmosewasser, pH 6,5-8,5 (bevorzugter Bereich: 6.8 -7.5) und eine Leitfähigkeit von 180-360 & mgr; S). Siehe Brand et al. 13 für weitere Rezepte. Acht bis zehn Tage vor die in – vitro – Kultur – Manipulation, mit einem Fischnetz eines einzelnen männlichen und weiblichen ein einzelnen Fische des gewünschten Stammes mit einem passenden Behälter zu übertragen. Paar mehrere Sätze. Lassen Sie sie in der Gegen Tank über Nacht. Lassen Sie sie im Laufe des Abends und durch den Nachmittag des folgenden Tages paaren. Verwenden Sie ein Fischnetz die Weibchen zu trennen, die Eier während der Paarung ergeben und sie in einen separaten Tank. Füttert diese Frauen zweimal täglich mit einer Futtermischung haltendenng etwa eine gleiche Menge an Artemia und Fischfutterflocken. Die Menge der Nahrung sollte ausreichen, um etwa 20 min zur Verfügung zu stellen, aber nicht mehr, der Fütterungszeit. 2. Herstellung von Reifungsmedium HINWEIS: Bereiten Sie Reifungsmedium am Tag des In – vitro – Reifung Experiments innerhalb von 1 h den Eizellen von den weiblichen entfernen (siehe Abschnitt 3). 20 ml von Leibovitz L-15-Medium mit L-Glutamin, pH 7,0, in ein 50 ml konischen Röhrchen unter sterilen Bedingungen. Bringen auf pH 9,0 mit 10 N NaOH. Fügen 9 ml Leibovitz L-15-Medium, pH 9,0, auf 2 separate 50 ml konischen Röhrchen. Label 1 tube "DHP +" und die andere "-DHP." In dem Rohr + DHP, mit 10 & mgr; l von 17α-20β-dihydroxy-4 – pregnen-3-on (DHP), 490 & mgr; l dH 2 O und 500 & mgr; l von 10% igem Rinderserumalbumin (BSA). Im -DHP Rohr wurde mit 100 & mgr; l von 10 mg / ml Gentamycin, 40081; l dH 2 O und 500 & mgr; l 10% BSA. 3. Dissection der Oozyten und Initiation der In – vitro – Kultur HINWEIS: Das in – vitro – Kultur Experiment 8-10 Tage mit vorgewählten Frauen durchgeführt , nachdem sie Eier durch natürliche Paarung lösen. Verwenden Sie Reifungsmedium am selben Tag gemacht (siehe Abschnitt 2). Oozyten reift angemessen , wenn die Präparation in der Nähe des Endes des Fischtageszyklus (bestimmt im Labor durch voreingestellter künstliche Beleuchtung in der Fischanlage) 13 begonnen wird, möglicherweise Prozesse imitiert durch natürliche Paarung auftreten. Dies bedeutet , dass die meisten Schritte im Protokoll muss am Abend durchgeführt werden , wenn Fisch in einer Anlage mit einem Standard – Lichtzyklus untergebracht ist (zB Anfang Schritt 3.2 um 6 Uhr in einer Anlage mit einer 8.00 bis 10.00 Lichtperiode), obwohl andere Arbeitszeitperioden möglich sind mit einem entsprechend zeitverschobene Lichtzyklus. Vorbereiten einer 0,2% Tricaine Stammlösung in dH 2 O, gepuffert auf pH 7,0 mit 1 M Tris, pH 9,0, und halten diese Lösung bei 4 ° C. Dies kann vor der Zeit vorbereitet werden. Starten Sie den Versuch 0-4 h vor dem Ende des täglichen Lichtzyklus in der Anlage. In einem 250-ml-Becherglas mit 20 ml 0,2% Tricaine Stammlösung, pH 7,0, zu 80 ml Wasser und Fisch mischen. Übertragen Sie die vorgewählten Weibchen Tricaine Lösung und einschläfern sie durch Überbelichtung. Lassen Sie die Frauen in der Tricaine Lösung für 15 Minuten nach Beendigung der Kiemenbewegung. Mit einem Löffel sammeln die eingeschläfert Fisch aus der Tricaine Lösung und spülen Sie sie kurz in Fischwasser. Den Fisch auf ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser zu absorbieren. Verwenden Sie einen sauberen Rasierklinge den eingeschläfert Fisch auf der Ebene der Brustflosse enthaupten. Verwendung Präparierscheren, stellt einen Längsschnitt an der Bauchseite des Fisches, von dem vorderen Ende zu dem Analbereich erstrecken. <li> Den Fisch auf einer Petrischale unter einem Binokular mit einfallendem Licht. Verwendung eines Paares von Dissektionszangen, übertragen Ovar Portionen zu einer 35 x 10-mm-Kulturschale mit 4 ml Leibovitz L-15 Medium + DHP. HINWEIS: Die Eierstöcke, die Entwicklung von Oozyten enthalten als opak und klumpig Strukturen innerhalb der inneren Körperhöhle angezeigt. Mit Dissektionszangen distanzieren sanft die Eizellen von den follikulären Massen. Sortieren der frühe Stufe IV – Oozyten (2B; vor GV Panne, bei nahezu maximaler Größe und durch ein dunkles, lichtundurchlässiges Zytoplasma und ein leicht ersichtlich GV in der Oocyte befand asymmetrisch gekennzeichnet). Discard Oozyten in früheren Stadien (Figur 2A) und durchscheinend, reifen Stadium V Eier (ähnlich wie in Figur 2C , aber die in den Ovarien vor der DHP – Behandlung). HINWEIS: Die Oozyten werden für die Reifung in einem frühen Stadium IV ausgewählt, zum frühestmöglichen Zeitpunkt, dass die Ergebnisse in der reifen, Stufe V oocytes nach dem in – vitro – Kulturbedingungen (2C und D) 3. Weil Stufe IV Oozyten aktiv Produkte produzieren, die Manipulation in dieser Phase erlaubt die Expression von exogenen RNA-Produkten durch Injektion oder für die Reduktion der Genfunktion über MOs eingeführt. Verwenden einer Glaspipette Pasteur der frühen Stufe IV-Oozyten zu einem zweiten 35 x 10 mm Kunststoff-Kulturschale mit 4 ml Leibovitz L-15 Medium + DHP zu übertragen. Übertragen minimale Mengen an -DHP Mediums in die Schale der + DHP Lösung enthält. 4. Oozyten-Mikroinjektionen HINWEIS: Getrennter Stufe IV Oozyten in vitro – Reifung unterzogen werden können mikroinjiziert Reagenzien für funktionelle Manipulation einzuführen oder markierte Protein – Expression. Die Mikroinjektion von Reagenzien, wie mRNA und MOs (siehe Abschnitt 4) wird typischerweise durchgeführt , wenn die Oozyten in vitro durchlaufen matuRation in + DHP Medium vor defolliculation. Wenn es gewünscht wird, um mehr Zeit zu lassen, Manipulationen durchzuführen vor der Oocytenreifung kann die Injektionen auch in -DHP Medium durchgeführt werden, vor der Reifung, für mindestens 2 h. Sie können anschließend auf + DHP-Medium übertragen werden. Bereiten Sie mRNAs ein Standardausdruck-Kit. Halten Sie sie bei -80 ° C als 100-500 pg / ul Lager zur Injektion in einer Endkonzentration von 50-500 pg / ul (200 pg / ul wird empfohlen) in RNA-grade Wasser. Bereiten MOs bei einer Konzentration von 4 ng / & mgr; l in Wasser gemäß der Anweisungen des Herstellers. Injizieren sie bei Endkonzentrationen von 2 ng / & mgr; l (oder empirisch bestimmt). HINWEIS: Die Injektionen werden üblicherweise in + DHP-Medium (siehe Hinweis in Abschnitt 5) vor dem defolliculation durchgeführt. Wenn mRNA die Injektion, unmittelbar vor der Injektion verdünnen den mRNA unter Verwendung von RNA-grade-Umkehrosmose-Wasser und 0,2 M KCl um eine Endlösung von 0,1 M KCl zu erreichen. Wenn MOs, unmittelbar vor dem Einspritzen eingespritzt wird, verdünnen die MOs auf die gewünschte Konzentration unter Verwendung von Umkehrosmose-Wasser und 0,2 M KCl um eine Endlösung von 0,1 M KCl zu erreichen. Manuell halten Oozyten mit feinen Pinzetten und ungefähr 1 nL in Wildtyp – Oozyten im Stadium IV mit einer ausgezogenen Glaskapillare Pipette hergestellt unter Verwendung einer Nadel injizieren. Bereiten Sie die Glasnadel durch erhitztes Glaskapillarrohre Ziehen Laden die Lösung eingespritzt werden soll, und brechen die Nadelspitze mit einer Zange, wie zuvor in 15 Protokollen für Standardeinspritzung in Zebrabärbling frühe Embryonen beschrieben. HINWEIS: Es ist hilfreich, wenn die Nadel eine allmähliche Verjüngung anstatt ein abrupt man hat; Dies ermöglicht mehr Flexibilität in Bezug auf den Standort der Pause in der Nadelspitze und hilft auch eine Beschädigung des injizierten Embryos zu verhindern. Unter Verwendung der gleichen Nadel und Lösung wie für die Embryo-Injektionen, stellen Sie das injizierte Volumen von vorge Bestimmung derMikroinjektor Druckeinstellungen, die das gewünschte Volumen herzustellen. Diese Einstellungen können durch mock-injizierende bestimmt werden in einen Tropfen Mineralöl auf einem Mikroskoptisch Kalibrierungsdia (0,01 mm) und Einstellen der Mikroinjektor – Einstellungen den gewünschten Durchmesser in dem Bolus von injizierten Lösung zu erhalten, wie zuvor beschrieben 15. 5. Eizellreifung und Defolliculation HINWEIS: Während der Eizellreifung, werden sich die Eizellen zunehmend durchscheinend, die für die Beurteilung der erfolgreichen Kulturbedingungen ermöglicht. Weiterhin die unreifen Inkubieren (und gegebenenfalls eingespritzt) Oozyten in + DHP Medium bei 26,5 ° C, in regelmäßigen Abständen überprüft (alle 30 Minuten) , um sicherzustellen , dass die Oozyten , intakt bleiben und durchlaufen die richtige Reifung durch progressives scheinend zu werden (siehe Abbildung 2c) . Entfernen Sie alle Lysieren Eizellen mit einer Pasteur-Pipette und entsorgen Sie siein einem Labor Abfallbecher die Qualität des Mediums zu halten. Tauschen Sie das Kulturmedium mit etwa einem halben Volumen frischen + DHP Medium um eine klare Lösung zu erhalten, abhängig von der Menge der Eizelle Lyse. Erlaubt die in vitro – Reifung fortschreiten , bis ein Großteil des Oozyten durchscheinend worden und hat eine GV , die nicht mehr erkennbar ist (ca. 2 h in DHP – Behandlung, siehe Figur 2C im Vergleich zu D). Sehen Sie sie unter einem Binokular mit Durchlichtoptik. Entfernen Sie die äußerste follikulären Membran aus jeder gereiften Oocyten. Verwenden extra feine Zange eine Träne in der follikulären Membranen in einer Region mit erhöhter Raum zwischen der Eizelle und der Membranen zu bilden. Abschälen eines Teils der Membran ab und rollen den Oozyten aus der Membran während der geschälte Teil gedrückt gehalten wird. HINWEIS: Der zugrunde liegende Chorionmembran bleibt typischerweise in enger Verbindung mit dem Ei während dieses Prozesses; nach Ei Aktivation, dehnt es sich für den Embryo um eine Schutzschicht zu bilden. Übertragen des defollikuliert Oozyten in einem minimalen Volumen von Medium (in der Regel etwa 5-10 übertragen reife Oocyten in weniger als 20 & mgr; l) in einer Petrischale mit einem paar Tropfen der Kultur (DHP +) -Medium und gehen zur Befruchtung. 6. Düngung von In – vitro – Cultured Oozyten HINWEIS: Die Sperma-Lösung auf Eis, unten vorbereitet, wird für ca. 2 h seine Wirksamkeit aufrechtzuerhalten. Vorbereiten einer Spermienlösung in der Nähe des Endes der Oocytenreifung Schritt und vor der Verwendung von fünf männlichen Hoden in 500 ul Hanks' Lösung defolliculation, wie zuvor 16, 17 beschrieben. In 10 bis 50 & mgr; l der Spermien Lösung für die defollikuliert Eizellen in + DHP Kulturmedium. 10 s warten. Mit einer Pipette wird ein paar Tropfen von embryonalem (E3) Medium zu den Oozyten. 1 min warten und dann die überfluten plmit E3 Medium aß. HINWEIS: Die Zusammensetzung des E3 – Medium ist wie folgt: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, und 1-5% Methylene Blue 13. Wiederholen Sie die Schritte 5.3, 6.2 und 6.3 auf eine größere Anzahl von befruchteten Embryonen zu erhalten. Lassen Sie die befruchteten Embryonen zu entwickeln. Verwenden eines Seziermikroskops mit Durchlichtoptiken die Progression durch die Furchungsstadien zu beobachten erfolgreiche Befruchtung zu gewährleisten, wie zuvor beschrieben für die Befruchtung 17 und Staging – 18.